[發明專利]一種右旋糖酐磁珠模擬BoHV-1病毒粒子的制備與應用

在審

• 申請號: 202210146015.3
• 申請日: 2022-02-17
• 公開（公告）號: CN114470183A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 倪宏波;劉行波;翟軍軍;葉超;王金良;張曉軒
• 申請（專利權）人: 青島農業大學;榆林學院;西南大學
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;A61K47/42;A61K47/36;A61K47/60;A61P31/22;C07K14/03;C12N15/38;C12N15/85
• 代理公司: 北京圣州專利代理事務所(普通合伙) 11818
• 代理人: 王振佳

1.一種右旋糖酐磁珠模擬BoHV-1病毒粒子的制備，其特征在于，步驟如下：

S1、合成牛皰疹病毒gB、gC、gD蛋白基因

按照GeneBank公布的BoHV-1gB、gC、gD基因序列，合成各個基因后，在gB上游加入HindⅢ酶切位點，其下游加入AgeⅠ酶切位點，gC/gD上游加入KpnⅠ酶切位點，其下游加入BSTBⅠ酶切位點；

S2、構建真核表達重組質粒

合成基因與pcDNA4-Myc-his真核表達質粒雙酶切后連接構建pcDNA4-gB-his/pcDNA4-gC-his/pcDNA4-gD-his真核表達質粒，真核表達質粒轉化DH5α大腸桿菌感受態以后，挑菌純化后大量培養使用英國biological tool無內毒素質粒大提試劑盒提取以上真核表達質粒；

S3、真核表達質粒轉染MDBK細胞

用PEI磁珠質粒轉染法將以上真核表達質粒轉染MDBK細胞系；

S4、構建真核表達細胞系

轉染48h后加入含有10％FBS和500μg/mL zeocine DMEM培養基37℃5％CO₂培養48h將未轉染成功的細胞殺死；

S5、真核表達蛋白純

收取細胞培養上清和轉染成功MDBK細胞，MDBK細胞經超聲破碎后，12000×g離心30分鐘沉淀細胞碎片收取上清用于下步純化；

S6、真核表達蛋白鑒定；

S7、右旋糖酐磁珠磁珠模擬BoHV-1病毒粒子制備。

2.根據權利要求1所述的一種右旋糖酐磁珠模擬BoHV-1病毒粒子的制備，其特征在于，步驟S3中，轉染細胞系的操作如下：

A、貼壁轉染

1)細胞按照傳代步驟操作，10⁵個/mL鋪6孔板貼壁鋪滿孔后開始轉染；

2)DNA與PEI磁珠無菌混合后用無菌ddH₂O稀釋5倍后備用；

3)消化后細胞棄去原培養基，無菌PBS清洗2遍；

4)將2)步磁珠加入到3)步細胞中，37℃CO₂培養箱中培養20-30min；

5)加入正常的培養基繼續培養，按正常傳代操作進行；

B、懸浮轉染

1)貼壁細胞消化后，300×g/min離心5min沉淀細胞棄掉培養基PBS清洗2遍在離心管中備用；

2)將DNA和磁珠按附表比例混合后，用無菌ddH₂O稀釋5倍后備用；

3)將上步混合物加入細胞中吹打懸浮細胞；

4)上步混合物放入培養箱培養20-30min；

5)加入新鮮培養基轉移到培養瓶或者培養皿中繼續培養傳代。

3.根據權利要求1所述的一種右旋糖酐磁珠模擬BoHV-1病毒粒子的制備，其特征在于，步驟S5中，用鎳磁珠對his標簽蛋白進行純化步驟如下：

1)磁珠洗滌：將磁珠用磁鐵吸附后加入適當體積2×bindingwash buffer洗滌2次，洗去磁珠保存液；

2)待純化樣品加入等體積的lysis buffer之后顛倒混勻；

3)磁珠顛倒混勻后取適量體積磁珠加入上一步樣品中，顛倒混勻3min；

4)磁鐵吸附磁珠，待磁珠吸附完全樣品澄清后棄掉樣品保留磁珠；

5)加入5mL 2×bindingwash buffer搖晃混勻后，磁鐵再次吸附磁珠，重復3次棄液體；

6)將上一步殘余液體用移液器吸干后加入his elution buffer 1mL浸泡磁珠2分鐘后，磁鐵吸附磁珠，收集液體放入另一個新的離心管中；

7)重復步驟5)兩次后，5mL水保存磁珠。