[發明專利]用于PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的引物探針組、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202210140285.3
• 申請日: 2022-02-16
• 公開（公告）號: CN114540546A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 趙陽;魏啟超;武守霖;孫彩云;袁丹陽;董雪瑩
• 申請（專利權）人: 哈爾濱中科基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市晨晟知識產權代理有限公司 23219
• 代理人: 劉坤

本發明涉及用于PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的引物探針組、試劑盒及檢測方法，屬于分子生物學技術領域。為進一步提高PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR聯檢的準確性，本發明提供了用于PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的引物探針組，以PRRSV的ORF6基因和CSFV的5′UTR非編碼區作為擴增靶區域設計的針對PRRSV的引物探針組和針對CSFV的引物探針組，保證了檢測基因位點的保守性和穩定性，引物探針組序列結構不存在相互作用，擴增效率和結合率高，具有很高的檢測敏感性。本發明提供的檢測試劑盒同相似病原體無交叉反應，具有較高的特異性和準確性，能滿足大批量快速鑒別檢測的要求。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及用于PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的引物探針組、試劑盒及檢測方法。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，簡稱PRRS)， 又稱豬藍耳病，主要由豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV引起，可導致妊娠母豬嚴重繁殖 失敗和各年齡豬的呼吸障礙，是一種嚴重影響養殖經濟效益的豬傳染病。古典豬瘟(Classical Swine Fever，簡稱CSF)，主要由豬瘟病毒CSFV引起，可導致豬群的高死亡 率和發病率，造成毀滅性的經濟損失，被世界動物衛生組織OIE列為A類傳染病。

由于豬繁殖與呼吸綜合征和古典豬瘟均可不同程度的引起豬繁殖性障礙，并且常常混 合感染，因此僅憑臨床癥狀、病理變化及流行病學調查很難做出準確診斷，尤其是在發病 的早期或潛伏期更難得到準確診斷。實時熒光定量PCR，即RT-PCR以其特異性強、靈敏度高、速度快等優點在基因表達水平分析、病原體基因的定性和定量檢測等方面得到廣泛應用，并且已經成為當前病毒核酸快速檢測的主要方法。

應用RT-PCR針對多種病毒進行同時聯檢時，不同病毒的引物、探針序列結構間如果 存在相互作用，極易對檢測靈敏度和準確度造成負面影響，導致檢測靈敏度的降低和結果 的不準確。同時病毒本身變異快、基因型和血清型多等因素也會影響RT-PCR聯檢的靈敏度和準確度。申請號為CN201110146877.8的發明專利《一種豬瘟病毒和豬藍耳病病毒的 雙色熒光定量PCR聯合檢測方法及其試劑盒》，可以實現在同一個待測樣本中同時檢測豬 瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒；但是，其豬繁殖與呼吸綜合征檢測的基因位點位于 ORF5基因，該基因存在高突變及同源重組。申請號為CN201510191676.8的發明專利《非 洲豬瘟病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的三重熒光RT-PCR檢測試劑及其方法 與用途》，在PRRSV的檢測位點為NSP2，該位點同樣保守性不高，甚至在高致病性豬繁 殖與呼吸綜合征病中，NSP2基因還存在大量缺失。檢測的基因位點如果發生突變或缺失， 甚至可能直接造成假陰性的檢測結果，降低了NSP2變異株的特異性，對病豬的確診造成 誤導。

因此，在進行多種病毒RT-PCR同步聯檢時，檢測基因位點的選擇和不同病毒的引物 探針組序列結構是否相互作用是決定檢測準確性的關鍵，然而兼具合適的檢測基因位點和 穩定的引物探針組序列結構并不是根據病毒的基因序列能夠顯而易見得到的，仍然是本領 域亟需解決的技術難點。

發明內容

為進一步提高PRRSV和CSFV二重RT-PCR聯檢的準確性，本發明提供了用于 PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的引物探針組、試劑盒及檢測方法。

本發明的技術方案：

一種用于PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的引物探針組，包括針對PRRSV 的引物探針組和針對CSFV的引物探針組；

所述針對PRRSV的引物探針組包括具有如下核苷酸序列的引物和探針：

正向引物PRRSV-D1-F：5′-ACCTGGAAATTCATCACCTC-3′；

反向引物PRRSV-D1-R：5′-CGACAAATGCGTGGTTATCA-3′；