[發明專利]用于PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的引物探針組、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202210140285.3
• 申請日: 2022-02-16
• 公開（公告）號: CN114540546A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 趙陽;魏啟超;武守霖;孫彩云;袁丹陽;董雪瑩
• 申請（專利權）人: 哈爾濱中科基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市晨晟知識產權代理有限公司 23219
• 代理人: 劉坤

1.一種用于PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的引物探針組，其特征在于，包括針對PRRSV的引物探針組和針對CSFV的引物探針組；

所述針對PRRSV的引物探針組包括具有如下核苷酸序列的引物和探針：

正向引物PRRSV-D1-F：5′-ACCTGGAAATTCATCACCTC-3′；

反向引物PRRSV-D1-R：5′-CGACAAATGCGTGGTTATCA-3′；

探針PRRSV-Probe：5′-FAM-TGCTAGGCCGCAAGTACATTC-BHQ1-3′；

所述針對CSFV的引物探針組包括具有如下核苷酸序列的引物和探針：

正向引物CSFV-D155-18F：5′-GGGTGGTCTAAGTCCTGA-3′；

反向引物CSFV-D325-18R：5′-CTAATAGTGGGCCTCTGC-3′；

探針CSFV-Probe：5′-ROX-CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-BHQ2-3′。

2.一種用于PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的正向引物PRRSV-D1-F、反向引物PRRSV-D1-R、探針PRRSV-Probe、正向引物CSFV-D155-18F、反向引物CSFV-D325-18R和探針CSFV-Probe。

3.根據權利要求2所述一種用于PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的試劑盒，其特征在于，還包括DNA聚合酶、逆轉錄混合酶、陰性對照品、PRRSV和CSFV的陽性對照品以及含有dNTP的PCR緩沖液。

4.根據權利要求3所述一種用于PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的試劑盒，其特征在于，所述PRRSV和CSFV的陽性對照品為PRRSV病毒的陽性質粒與CSFV病毒的陽性質粒的混合品，所述混合品中PRRSV病毒的陽性質粒與CSFV病毒的陽性質粒的濃度均為2.4×10^-4ng/ul；所述陰性對照品為無菌DEPC-H₂O。

5.根據權利要求4所述一種用于PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的試劑盒，其特征在于，所述PRRSV病毒的陽性質粒是以PRRSV ORF6基因序列保守片段中如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列為靶目標序列擴增所得產物與載體連接構建的重組質粒，擴增所用引物對具有如下核苷酸序列：

PRRSV-SF：5′-TTTCAGCGGAACAATGGGGTC-3′；

PRRSV-SR：5′-TTTCTGCCACCCAACACGAGG-3′；

所述CSFV病毒的陽性質粒是以CSFV 5′UTR基因序列保守片段中如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列為靶目標序列擴增所得產物與載體連接構建的重組質粒，擴增所用引物對具有如下核苷酸序列：

CSFV-S149-18F；5′-CTCCCTGGGTGGTCTAAG-3′；

CSFV-S729-18R；5′-GCTACCTGTCACCCTACC-3′。

6.一種用于PRRSV和CSFV二重熒光定量PCR檢測的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、提取待測樣本的基因組，以所得基因組RNA為模板，利用權利要求1所述引物探針組進行二重RT-PCR擴增，并在每個循環延伸結束時進行熒光信號檢測；

步驟二、對步驟一擴增所得PCR產物進行分析，基于特定擴增曲線生成情況及Ct值判斷待測樣本是否含有PRRSV和/或CSFV。