[發(fā)明專利]鯉TLR4鼠抗血清的制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210140002.5
• 申請日: 2022-02-16
• 公開（公告）號: CN114605545A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮軍廠;王先鋒;宋東鎣;常緒路;張建新
• 申請（專利權(quán)）人: 河南師范大學(xué)
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K16/06;C12N15/70;C07K14/705;G01N33/68;C12R1/19
• 代理公司: 新鄉(xiāng)市平原智匯知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 41139
• 代理人: 路寬

本發(fā)明公開了一種鯉TLR4鼠抗血清的制備方法及應(yīng)用，黃河鯉TLR4鼠抗血清的制備方法包括鯉TLR4基因開放閱讀框的克??；鯉TLR4基因重組表達(dá)載體pET?32a(+)?TLR4的構(gòu)建；鯉TLR4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western Blot的特異性分析；鯉TLR4鼠抗血清的制備。本發(fā)明采用分子生物學(xué)和基因工程的方法構(gòu)建了鯉TLR4基因的重組表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析獲得純化的重組表達(dá)蛋白。本發(fā)明制備的鯉TLR4鼠抗血清可用于（熒光）免疫組化、蛋白印跡和酶聯(lián)免疫吸附等實(shí)驗(yàn)要求，建立體外免疫分析、研究鯉TLR4的功能以及鯉免疫熒光染色激光共聚焦顯微觀察，還可用于其他鯉科魚類TLR4的免疫檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鯉Toll樣受體4鼠抗血清的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

Toll基因由Nusslein-Volhard及其團(tuán)隊(duì)于1980年在進(jìn)行果蠅相關(guān)研究的過程中被發(fā)現(xiàn)，并為其命名。研究顯示，該受體在抗細(xì)菌、真菌等病原體中發(fā)揮著不可替代的作用，并且參與轉(zhuǎn)導(dǎo)了抗菌感染易感性信號。Toll樣受體4(Toll-Like Receptor 4，TLR4)是TLR家族中不可或缺的一份子，在先天性免疫中具有無可替代的地位。存在于哺乳動物體內(nèi)的TLR4主要識別的受體是LPS，但TLR4并不能直接識別相應(yīng)的配體，TLR4需要LBP、MD-2和CD14一起協(xié)同作用才能識別LPS。由于識別LPS的唯一受體是TLR4/MD-2復(fù)合物，因此TLR4首先需要與輔助受體MD-2結(jié)合，形成TLR4/MD-2受體復(fù)合物后才能與LPS結(jié)合。LBP是可溶性蛋白，在其結(jié)合LPS后再與CD14結(jié)合，然后CD14再將LPS轉(zhuǎn)移到唯一受體TLR4/MD-2復(fù)合物上進(jìn)而啟動下游的信號通路。

研究發(fā)現(xiàn)魚類中LPS不能誘導(dǎo)TLR4進(jìn)行表達(dá)，魚體內(nèi)也沒有CD14和MD-2。所以魚體中可能存在別的受體可以識別LPS。但在草魚中，病毒可以誘導(dǎo)TLR4進(jìn)行表達(dá)，所以在魚類中TLR4雖然不能識別LPS但可以識別病毒。鯉是我國主要的經(jīng)濟(jì)淡水魚類，在我國具有較大的養(yǎng)殖規(guī)模。然而，在養(yǎng)殖過程中細(xì)菌性疾病已成為制約鯉養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的限制因素。因此，深入研究鯉的免疫機(jī)制，有助于建立提高鯉機(jī)體免疫的方法，對鯉養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。哺乳動物的研究中，關(guān)于Toll樣受體大多是蛋白水平的檢測。由于水產(chǎn)上缺少相應(yīng)的抗體，致使在目前的探究實(shí)驗(yàn)中水產(chǎn)動物在Toll樣受體的檢測大部分局限于mRNA水平，限制了進(jìn)一步的深入研究。

為了解決這一技術(shù)問題，從鯉中克隆獲得TLR4基因，通過原核表達(dá)和免疫小鼠的方法制備鯉TLR4鼠抗血清，通過免疫組化實(shí)驗(yàn)，對該抗血清的特異性進(jìn)行檢驗(yàn)，并分析其在腸道中的表達(dá)情況，對進(jìn)一步研究TLR4在宿主腸道中的免疫功能具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種鯉TLR4鼠抗血清的制備方法及應(yīng)用，該方法制備的鯉TLR4鼠抗血清能夠用于蛋白檢測的實(shí)驗(yàn)要求，如(熒光)免疫組化、蛋白印跡和酶聯(lián)免疫吸附等，建立體外分析、研究鯉TLR4的功能以及鯉免疫熒光染色激光共聚焦顯微觀察，還可用于其他鯉科魚類TLR4的檢測。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案，鯉TLR4鼠抗血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟S1：鯉TLR4基因開放閱讀框的克隆

Trizol提取鯉腸組織總RNA，經(jīng)1.0wt％瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，隨后用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，于-80℃保存?zhèn)溆茫鶕?jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的TLR4基因序列設(shè)計(jì)第一對特異性引物TLR4-ORF-F和TLR4-ORF-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得鯉TLR4基因開放閱讀框片段，其中第一對特異性引物為：

上游引物TLR4-ORF-F的引物序列為5'-ATGACTTTCTTTACTATTACTGAGA-3'；

下游引物TLR4-ORF-R的引物序列為5'-TTATTGGTTTGTAGCAATAATA-3'；