[發明專利]鯉TLR4鼠抗血清的制備方法及應用

在審

• 申請號: 202210140002.5
• 申請日: 2022-02-16
• 公開（公告）號: CN114605545A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 馮軍廠;王先鋒;宋東鎣;常緒路;張建新
• 申請（專利權）人: 河南師范大學
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K16/06;C12N15/70;C07K14/705;G01N33/68;C12R1/19
• 代理公司: 新鄉市平原智匯知識產權代理事務所(普通合伙) 41139
• 代理人: 路寬

1.鯉TLR4鼠抗血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟S1：鯉TLR4基因開放閱讀框的克隆

Trizol提取鯉腸組織總RNA，經1.0wt％瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，隨后用M-MLV反轉錄酶合成cDNA第一鏈，于-80℃保存備用，根據GenBank數據庫中已報道的TLR4基因序列設計第一對特異性引物TLR4-ORF-F和TLR4-ORF-R，進行PCR擴增獲得鯉TLR4基因開放閱讀框片段，其中第一對特異性引物為：

上游引物TLR4-ORF-F的引物序列為5'-ATGACTTTCTTTACTATTACTGAGA-3'；

下游引物TLR4-ORF-R的引物序列為5'-TTATTGGTTTGTAGCAATAATA-3'；

步驟S2：鯉TLR4基因重組表達載體的構建

根據鯉TLR4基因ORF全長cDNA序列設計第二對特異性引物TLR4-YHBD-F和TLR4-YHBD-R，并分別在上、下游引物添加BamH I和Hind III酶切位點，再以鯉cDNA為模板，TLR4-YHBD-F和TLR4-YHBD-R分別為上、下游引物，進行PCR擴增，將PCR產物經膠回收后和pET-32a(+)表達載體進行雙酶切，膠回收純化，經T4酶連接后轉入克隆感受態DH5α，獲得重組表達載體pET-32a(+)-TLR4，其中第二對特異性引物為：

上游引物的引物序列為5′-CGGGATCCAGATGCCAAATCAAGCAC-3′；

下游引物的引物序列為5′-CCAAGCTTAGCAGCAGATGAAACAAAG-3′；

其中下劃線部分為酶切位點；

步驟S3：鯉TLR4重組蛋白的誘導表達、純化及Western Blot特異性分析

將步驟S2得到的重組表達載體pET-32a(+)-TLR4轉入表達感受態BL21(DE3)，在含有氨芐抗性的LB培養液中于37℃培養至OD值為0.5-0.6時，加入IPTG進行誘導培養，經離心收集菌體、PBS重懸后加入5×上樣緩沖液沸水浴10min，經12wt％SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況，并做相應的對照組；

以1wt％的接種量將能表達重組蛋白的菌液添加到含有氨芐抗性的LB培養基中，擴大培養，于37℃培養至OD值為0.5-0.6時，加入IPTG進行誘導培養，將誘導培養好的菌液離心，收集菌體用變性結合緩沖液重懸浮后采用超聲波破碎的方法獲得融合蛋白的包涵體，借助變性洗脫緩沖液通過His Trap HP柱對融合蛋白進行純化，并用透析方法去除融合蛋白溶液中的CH₄N₂O和C₃H₄N₂鹽離子，獲得純化的鯉TLR4重組蛋白；

步驟S4：鯉TLR4鼠抗血清的制備

將步驟S3純化的鯉TLR4重組蛋白作為抗原，蛋白質濃度用0.85wt％的生理鹽水調整為500μg/mL后對小鼠進行5次免疫，按體積比1:1的比例加入弗氏佐劑，初次免疫選用復試完全佐劑，采用腹部皮下多點注射，隨后每隔1周加強免疫1次，共免疫5次，加強免疫選用弗氏不完全佐劑，末次免疫10天后進行全血分離，收集鼠抗血清，純化得到鯉TLR4鼠抗血清。

2.根據權利要求1所述的鯉TLR4鼠抗血清的制備方法，其特征在于：步驟S1中所述第一對特異性引物進行PCR擴增時，每25μL的PCR擴增的反應體系包括ddH₂O 9.5μL、PremixTaqTM 12.5μL、TLR4-ORF-F 1.0μL、TLR4-ORF-R 1.0μL和cDNA 1.0μL；所述第一對特異性引物進行PCR擴增時的反應條件為：95℃預變性5min；35次循環中包括94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸3min；最后72℃延伸10min。