[發明專利]用于空間轉錄組測序的組織透化方法

在審

• 申請號: 202210138701.6
• 申請日: 2022-02-15
• 公開（公告）號: CN114540463A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 鄭洪坤;劉敏;張夢龍;劉晨陽
• 申請（專利權）人: 北京百邁客生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發明提供一種用于空間轉錄組測序的組織透化方法，包括組織貼片、固定及染色，組織透化，熒光cDNA合成，組織移除和熒光掃描成像等步驟。利用該方法可對組織樣本進行透化，逆轉錄及組織移除，并根據熒光信號選擇最優透化條件。該方法與傳統方法相比，優點在于兼容范圍廣，操作性強，重復性好，成本低等。該方法主要應用于空間轉錄組的組織優化流程。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種用于空間轉錄組測序的組織透化方法。

背景技術

在多細胞生物中，單個細胞的基因表達嚴格按特定的時間和空間順序發生，即基因表達具有時間特異性和空間特異性。時間特異性可以通過對不同時間點的樣本取材，使用單細胞轉錄組測序技術來解析時間維度上細胞類型和基因表達模式。空間特異性信息則相對較難獲得。常規轉錄組測序和單細胞轉錄組測序都難以還原細胞所處的原始位置信息。傳統的原位雜交技術又很難實現高通量檢測。因此發展空間轉錄組技術實現細胞的位置信息的保留尤為必要。

空間基因組學仍是一個新興發展領域，市場主要有三個商業化的參與者10xGenomics，Nanostring，Readcoor。2019年12月，10x Genomics宣布收購Spatial一年之際，Visium平臺正式推出，成為了第一款走入商業化進程的空間轉錄組產品。它的優勢在于組織兼容性強，無偏性捕獲所有mRNA；易與其他病理分析的方法和工具整合，也易和NGS流程整合，平臺具有較強的擴展性，容易被接受整合進現有的實驗室。NanoString于2019年推出GeoMx DSP，用于組織切片空間原位高通量蛋白和基因的表達檢測。它與10x Visium相比，工作流程更加自動化，對于樣本質量要求低，無需高質量的RNA，同時適用于FFPE，但它是一種靈活性較低的專用平臺，抗體和探針的設計明確針對腫瘤免疫和神經科學的具體應用。ReadCoor最早在2020年的AGBT大會上推出，它相較于10X平臺最大的優勢在于無與倫比的細胞分辨率。但以上三種平臺的共性為價格昂貴，其中廣泛應用的10x Visium平均市場價格為3.5萬元一個樣本。

組織優化玻片用于摸索某個組織類型的最佳透化時間。組織優化玻片上的oligo沒有spatial barcode，也不會構建測序文庫，當合成一鏈cDNA時，在反應體系中加入帶有熒光基團的核苷酸，這樣合成出來的cDNA就帶有熒光。通過熒光強度可以反映出組織中mRNA釋放量的多少，從而確定某個組織類型最佳的透化時間。通常情況下，選擇熒光信號最強、RNA擴散最少、內部組織結構最清晰的時間點作為最佳透化時間點。如果發現熒光信號發生擴散，說明透化時間過長。在確定最佳透化時間之后，就可以使用最佳透化時間開始空間基因表達的正式實驗。因此，合適的組織透化工藝條件成為實現該技術的關鍵。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于空間轉錄組測序的組織透化方法。

為了實現本發明目的，本發明提供一種用于空間轉錄組測序的組織透化方法，包括以下步驟：

(1)組織貼片、固定及染色：將新鮮冷凍組織切片貼于生物芯片指定區域，然后將芯片放入固定液中固定，并進行HE染色及掃描儀成像；

其中，所述生物芯片帶有mRNA捕獲探針；

(2)組織透化：將步驟(1)所得芯片放入組織透化液中孵育一段時間后，去除組織透化液(然后向芯片孔內加入0.1×SSC溶液)；

其中，所述組織透化液的組成如下：組織透化原液60μl+0.1M HCl 5940μl；所述組織透化原液的配制方法為：將0.1g胃蛋白酶溶于1000μl無核酶水中；

(3)熒光cDNA合成：(去除芯片孔內0.1×SSC溶液)向芯片孔內加入含有熒光基團的cDNA合成試劑進行cDNA合成；

(4)組織移除：去除cDNA合成試劑，向芯片孔內加入組織移除液；

(5)熒光掃描成像。