[發明專利]一種制備高質量地黃原生質體的方法

在審

• 申請號: 202210137430.2
• 申請日: 2022-02-15
• 公開（公告）號: CN114540269A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 楊艷會;楊慕榮;董柯煒;崔柳青;李瑞芳;張高陽;伊艷杰;譚曦;王馳
• 申請（專利權）人: 河南工業大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了一種制備高質量地黃原生質體的方法，包括如下步驟：(1)地黃葉片預處理：取地黃幼苗葉片，剪成細條狀，置于緩沖液中避光浸泡處理；(2)酶解：將預處理后的地黃葉條轉移到酶解液中，避光振蕩酶解；(3)原生質體分離；(4)原生質體純化：分離的原生質體使用緩沖液重懸；重懸后液體添加于蔗糖鹽溶液上層，離心；離心后中層為原生質體帶。本發明方法簡單，制備的原生質體形態規則，結構完整，活體原生質體含量高、質量好，為利用地黃原生質體作為實驗材料進行遺傳轉化、快速繁殖、體細胞雜交、優良品種的選育等遺傳與分子生物學領域的研究奠定基礎。

技術領域

本發明屬于原生質體制備技術領域，具體涉及一種制備高質量地黃原生質體的方法。

背景技術

地黃(Rehmannia glutinosa Libosch)為多年生玄參科草本植物，其塊根中含有梓醇、地黃苷、強心甙、多糖等生物活性物質，具有滋陰補血、清熱生津、益精填髓等多種功效，在臨床上廣泛應用。

由于地黃種子是高度雜合體，其雜交后代容易出現嚴重分離，生產上利用多代塊根的營養繁殖方法又容易造成病毒侵染，因此，利用離體培養和快速繁殖技術是地黃遺傳改良獲得優良品種的主要途徑。然而，目前比較成熟的地黃葉片外植體離體培養再生系統存在培養時間長、成苗率低等缺點。

原生質體具有再生與親本相似個體的全能性，可作為理想的實驗材料被廣泛地應用于植物快速繁殖、體細胞遺傳學、育種學、病毒學等領域的研究中。現有模式植物原生質體制備方法研究比較成熟，但由于地黃葉片細胞壁主要成分與模式植物的材料有所差異，采用常規的方法(市場上銷售的植物(擬南芥)原生質試劑盒)，細胞壁酶解不完全，難易獲得高質量的原生質體，無法用于地黃遺傳轉化、快速繁殖、體細胞雜交等后續實驗。而目前研究人員針對地黃進行原生質體的制備主要存在以下缺點：

(1)原生質體制備前要進行組織固定預處理，其步驟繁瑣，容易破壞細胞結構完整性，制備率低。

(2)采用磷酸緩沖液作為滲透壓穩定劑，不利于下游實驗。

(3)獲得的結構完整原生質體數量少，破損細胞的雜質多，不利于后期實驗。

因此，亟待提供一種高質量的地黃原生質體的制備方法，以解決地黃原生質體制備時出現的質量差、產量低的問題。

發明內容

本發明公開了一種制備高質量地黃原生質體的方法，有效解決原生質體質量差、得率低的問題。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種制備高質量地黃原生質體的方法，包括如下步驟：

(1)地黃葉片預處理：

取地黃幼苗葉片，剪成細條狀，置于緩沖液中避光浸泡處理；

緩沖液包括：MES 0.02M，甘露醇0.5M，KCl 0.009M，CaCl₂0.005M；

(2)酶解：

將預處理后的地黃葉條轉移到酶解液中，避光振蕩酶解；

酶解液包括：纖維素酶2w/v％，果膠酶0.6w/v％，甘露醇0.5M；

(3)原生質體分離；

(4)原生質體純化：

分離的原生質體使用緩沖液重懸；

重懸后液體添加于蔗糖鹽溶液上層，離心；

離心后中層為原生質體帶。