[發(fā)明專利]一種制備高質(zhì)量地黃原生質(zhì)體的方法

在審

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• 申請日: 2022-02-15
• 公開（公告）號: CN114540269A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊艷會;楊慕榮;董柯煒;崔柳青;李瑞芳;張高陽;伊艷杰;譚曦;王馳
• 申請（專利權(quán)）人: 河南工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

1.一種制備高質(zhì)量地黃原生質(zhì)體的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)地黃葉片預(yù)處理：

取地黃幼苗葉片，剪成細(xì)條狀，置于緩沖液中避光浸泡處理；

所述緩沖液包括：MES 0.02M，甘露醇0.5M，KCl 0.009M，CaCl₂ 0.005M；

(2)酶解：

將預(yù)處理后的地黃葉條轉(zhuǎn)移到酶解液中，避光振蕩酶解；

所述酶解液包括：纖維素酶2w/v％，果膠酶0.6w/v％，甘露醇0.5M；

(3)原生質(zhì)體分離；

(4)原生質(zhì)體純化：

分離的原生質(zhì)體使用所述緩沖液重懸；

重懸后液體添加于蔗糖鹽溶液上層，離心；

離心后中層為原生質(zhì)體帶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備高質(zhì)量地黃原生質(zhì)體的方法，其特征在于，

步驟(1)中，

使用培養(yǎng)15±2d地黃幼苗，取已完全展開的葉片，去主葉脈后，剪成細(xì)條狀，進(jìn)行后續(xù)處理。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備高質(zhì)量地黃原生質(zhì)體的方法，其特征在于，

步驟(1)中，

避光浸泡處理為25±2℃、避光靜置浸泡2h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備高質(zhì)量地黃原生質(zhì)體的方法，其特征在于，

步驟(2)中，

地黃葉條與酶解液用量比為1g：20mL，

避光振蕩酶解為25±2℃、55r/min避光酶解4h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備高質(zhì)量地黃原生質(zhì)體的方法，其特征在于，

步驟(3)中，

酶解后過濾，收集濾液；

濾渣洗滌后再過濾；

合并濾液，離心。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種制備高質(zhì)量地黃原生質(zhì)體的方法，其特征在于，

步驟(3)中，

酶解后使用200目濾網(wǎng)過濾；

濾渣使用所述緩沖液沖洗2-3次，過濾，合并濾液，離心；

濾液離心條件為4℃、700r/min離心3-5min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備高質(zhì)量地黃原生質(zhì)體的方法，其特征在于，

步驟(4)中，

重懸后液體與蔗糖鹽溶液體積比為1:5；

蔗糖鹽溶液為所述緩沖液添加蔗糖制成，蔗糖在蔗糖鹽溶液中的濃度為21w/v％；

離心條件為4℃、700r/min離心3-5min。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備高質(zhì)量地黃原生質(zhì)體的方法，其特征在于，

步驟(4)中，

吸取原生質(zhì)體帶，加入所述緩沖液，離心后再用所述緩沖液重懸。

9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的一種制備高質(zhì)量地黃原生質(zhì)體的方法在地黃遺傳轉(zhuǎn)化、快速繁殖、體細(xì)胞雜交或品種選育中的應(yīng)用。

10.利用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述方法制備的原生質(zhì)體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)純化后的原生質(zhì)體加入質(zhì)粒DNA，輕輕混勻；

(2)加入PEG 4000溶液，混勻，遮光放置；

PEG 4000溶液包括：PEG 4000 40w/v％，甘露醇0.5M，CaCl₂ 0.1M；

(3)加入W5溶液，轉(zhuǎn)化終止，離心棄上清，加入W5溶液懸浮沉淀，暗培養(yǎng)；

W5溶液包括：葡萄糖0.005M，NaCl 0.15M，CaCl₂ 0.125M，KCl 0.005M，MES 0.0015M；

(4)再次離心，重懸浮沉淀，即得到轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體。