[發(fā)明專利]一種基于體細(xì)胞胚途徑的獨(dú)蒜蘭組織快繁方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210136194.2
• 申請日: 2022-02-15
• 公開（公告）號: CN114431145B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 柴偉國;裘劼人;童建新;周歷萍
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州中港知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33353
• 代理人: 張曉紅

一種基于體細(xì)胞胚途徑的獨(dú)蒜蘭組織快繁方法，屬于組培擴(kuò)繁技術(shù)領(lǐng)域。采用開花結(jié)果后的1~3個月的獨(dú)蒜蘭果莢內(nèi)壁組織為外植體，以B5培養(yǎng)基為初代培養(yǎng)基，誘導(dǎo)形成愈傷組織，并繼續(xù)培養(yǎng)形成綠色叢生芽，后采用MS作為繼代培養(yǎng)基進(jìn)行增殖擴(kuò)繁，綠色叢生芽在形態(tài)上進(jìn)一步分化形成原球莖叢，原球莖直徑超過0.5cm時采用1/2MS生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，生根良好的健壯瓶苗移栽到基質(zhì)中進(jìn)行馴化、栽培，最終形成的獨(dú)蒜蘭種苗。上述一種獨(dú)蒜蘭組培快繁方法，可以解決無法從葉片、假鱗莖和根尖等植株組織誘導(dǎo)生成愈傷組織，并進(jìn)一步組培擴(kuò)繁獨(dú)蒜蘭健康種苗的難題，可以快速、批量擴(kuò)繁獨(dú)蒜蘭。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于組培擴(kuò)繁技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于體細(xì)胞胚途徑的獨(dú)蒜蘭組織快繁方法。

背景技術(shù)

獨(dú)蒜蘭[Pleione bulbocodioides (Franch.)Rolfe]是蘭科獨(dú)蒜蘭屬多年生草本植物，獨(dú)蒜蘭屬約有20種，中國分布有16種，其中獨(dú)蒜蘭和云南獨(dú)蒜蘭俗稱冰球子，和毛慈菇杜鵑蘭一起合稱為山慈菇，是傳統(tǒng)名貴中藥材，有清熱解毒、化痰散結(jié)之效，主要用于治療臃腫療毒、瘰疬痰核、蛇蟲咬傷等。獨(dú)蒜蘭花型美觀，有較高的觀賞價值，同時又有極高的藥用價值，有較大的市場需求。隨著對獨(dú)蒜蘭的深入研究和新產(chǎn)品的開發(fā)，市場對獨(dú)蒜蘭的需求不斷增大，長期以來，獨(dú)蒜蘭都依靠采挖野生資源滿足市場需求，但是人們無節(jié)制的采挖和野生環(huán)境的破壞，獨(dú)蒜蘭野生資源急劇減少，種質(zhì)資源生物多樣性遭到嚴(yán)重的破壞。獨(dú)蒜蘭果實為蒴果，透水透氣性較差，同時獨(dú)蒜蘭種子細(xì)小、無胚乳，種子沒有貯藏足夠的營養(yǎng)物質(zhì)供其萌發(fā)，在自然條件下很難萌發(fā)成苗，其有性繁殖率較低，且獨(dú)蒜蘭生長周期長，以種子繁殖到開花結(jié)實需要4～5年。因此，獨(dú)蒜蘭種群數(shù)量在自然條件下增殖很慢，群落更新能力弱，很難對人為造成的破壞進(jìn)行恢復(fù)。近年來隨著野生資源的減少和市場需求的上升以及人們對野生資源保護(hù)意識的覺醒，開始對獨(dú)蒜蘭進(jìn)行人工種植。目前，獨(dú)蒜蘭的繁殖主要是依靠假鱗莖進(jìn)行無性繁殖，每年增殖2～3倍，繁殖系數(shù)較低。植物組織培養(yǎng)通過提供合適的營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件，以植物組織為材料，能快速有效地培育新的植株，實現(xiàn)獨(dú)蒜蘭種質(zhì)資源快速繁殖。

植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細(xì)胞的全能性和植物的再生理論，植物不同組織分化程度不同，其脫分化恢復(fù)分裂的能力和形成愈傷組織的再分化能力也不同。因此，在組織培養(yǎng)中，選擇合適的外植體是試驗?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵因素。陳之林等人對白花獨(dú)蒜蘭進(jìn)行了組培快繁研究, 以種子和原球莖為外植體成功獲得了組培苗。屈云慧等人以二葉獨(dú)蒜蘭的種子為外植體成功獲得了組培苗。易瑾等人利用疣鞘獨(dú)蒜蘭和巖生獨(dú)蒜蘭的種子成功獲得了組培苗。張燕等以獨(dú)蒜蘭種子、組培苗的原球莖和葉片為材料進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)以種子和原球莖為外植體能培養(yǎng)出新的植株，而以葉片為材料則不能得到新的組培苗。吳麗芳等對滇獨(dú)蒜蘭的種子、假鱗莖和葉片進(jìn)行組織培養(yǎng)，結(jié)果表明種子通過培養(yǎng)能得到組培苗，而以假鱗莖和葉片為外植體均未獲得組培苗。黃成林等以獨(dú)蒜蘭種子、假鱗莖和假鱗莖細(xì)胞懸浮液為材料進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)假鱗莖培養(yǎng)后雖然能產(chǎn)生愈傷組織增殖小原球莖并萌發(fā)葉片，但生長異長，而以假鱗莖細(xì)胞懸浮液為材料則不能獲得植株，只有以種子為外植體能培養(yǎng)出健康的組培苗。從前人研究可見，以種子和原球莖為外植體能培養(yǎng)出新的植株，而以葉片為材料則不能得到新的組培苗，鱗莖為外植體很難獲得植株，本發(fā)明提供了一種基于體細(xì)胞胚途徑的組織快繁技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供了一種基于體細(xì)胞胚途徑的組織快繁技術(shù)方案，解決無法從葉片、假鱗莖和根尖等植株組織誘導(dǎo)生成愈傷組織，并進(jìn)一步組培擴(kuò)繁獨(dú)蒜蘭健康種苗的難題，實現(xiàn)快速、批量擴(kuò)繁獨(dú)蒜蘭種苗。

所述的一種獨(dú)蒜蘭組培擴(kuò)快方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）外植體的選擇與滅菌

外植體的選擇：選擇健康的3~4年的植株，在獨(dú)蒜蘭開花期間進(jìn)行人工輔助授粉，提高坐果率，經(jīng)過1~3個月精心培育，在果莢成熟轉(zhuǎn)黃前采摘，要求果莢外皮青綠色，無病斑無傷疤，果莢內(nèi)壁組織幼嫩、外皮組織未完全纖維化；