[發明專利]一種T細胞向腫瘤遷移的負調控因子的體外篩選、鑒定方法

有效

• 申請號: 202210133750.0
• 申請日: 2022-02-10
• 公開（公告）號: CN114517210B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發明（設計）人: 劉夏;馮新華;汪靜雯;牟成林
• 申請（專利權）人: 浙江大學杭州國際科創中心
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/87;C12N5/10;C12Q1/02;C12Q1/6869;C12Q1/6888
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 周敏

1.一種免疫細胞向腫瘤遷移的負調控因子的體外篩選、鑒定方法，其特征在于，所述的篩選方法、鑒定方法包括：

步驟1、采用SLICE技術對免疫細胞進行基因組編輯；

步驟2、采用嘌呤霉素puro篩選穩定表達的經基因組編輯的免疫細胞并進行擴增培養；

步驟3、將擴增培養后的經基因組編輯的免疫細胞在驅動劑的作用下進行Transwell遷移實驗，分別收集Transwell上室和下室中的細胞，比較基因未敲除和基因敲除后的細胞遷移效率變化和/或提取基因組DNA，通過PCR擴增基因組中的sgRNA所對應的DNA序列，并對擴增后的DNA序列進行二代測序。

2.根據權利要求1所述的體外篩選、鑒定方法，其特征在于，所述的免疫細胞為T細胞。

3.根據權利要求1所述的體外篩選、鑒定方法，其特征在于，所述的驅動劑為趨化因子、腫瘤細胞的培養上清液或實體瘤中的一種或多種。

4.根據權利要求2所述的體外篩選、鑒定方法，其特征在于，所述的驅動劑為趨化因子CXCL9和/或趨化因子CXCL10，在經基因組編輯的T細胞表面的CXCR3表達水平最高的時段進行Transwell遷移實驗。

5.根據權利要求1或4所述的體外篩選、鑒定方法，其特征在于，所述的步驟1包括：

步驟a1、采用sgRNA文庫慢病毒感染免疫細胞；

步驟a2、向步驟a1中的感染后的免疫細胞中電轉Cas9蛋白；

步驟a3、電轉結束后，加入不含IL-2的培養基于30~40℃下孵育20~50 min，

其中，步驟a2中使用的電轉體系為100μL Lonza電轉buffer中溶解5×10⁶~10×10⁶個免疫細胞和3~5μM Cas9蛋白，

步驟a3中使用的培養基的配方為：

RPMI-1640培養基 200~300 mL；

X-vivo15 media無血清細胞培養基 200~300 mL；

谷氨酰胺 2~8 mL；

青霉素-鏈霉素溶液 2~8 mL；

FBS胎牛血清 5 %~15 %。

6.根據權利要求5所述的體外篩選、鑒定方法，其特征在于，所述的免疫細胞為CD3⁺ T細胞、CD4⁺ T細胞或CD8⁺ T細胞中的一種或多種；

孵育結束后，加入40~60μMβ-巰基乙醇，5~15 mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，0.5~1.5 mM丙酮酸鈉，80~120μM NEAA細胞培養添加物，2~8ng/mL IL-15，5~15 ng/mL IL-7，400~600IU/ml IL-2繼續培養60~84 h。