[發明專利]一種T細胞向腫瘤遷移的負調控因子的體外篩選、鑒定方法

有效

• 申請號: 202210133750.0
• 申請日: 2022-02-10
• 公開（公告）號: CN114517210B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發明（設計）人: 劉夏;馮新華;汪靜雯;牟成林
• 申請（專利權）人: 浙江大學杭州國際科創中心
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/87;C12N5/10;C12Q1/02;C12Q1/6869;C12Q1/6888
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 周敏

本發明提供一種免疫細胞向腫瘤遷移的負調控因子的體外篩選、鑒定方法。為了尋找能夠驅動T細胞向腫瘤遷移的負調控基因，本發明的體外篩選、鑒定方法包括：步驟1、采用SLICE技術對免疫細胞進行基因組編輯；步驟2、采用嘌呤霉素puro篩選穩定表達的經基因組編輯的免疫細胞并進行擴增培養；步驟3、將擴增培養后的經基因組編輯的免疫細胞在驅動劑的作用下進行Transwell遷移實驗，分別收集Transwell上室和下室中的細胞并進行基因測序分析。本發明適用于趨化因子、腫瘤細胞培養上清及腫瘤對免疫細胞的驅動作用，適用于各種免疫細胞向腫瘤遷移的負調控因子的篩選或鑒定，將大大推進抗腫瘤免疫治療的發展。

技術領域

本發明屬于抗腫瘤免疫治療領域，具體涉及一種T細胞向腫瘤遷移的負調控因子的體外篩選、鑒定方法。

背景技術

隨著人類對免疫系統和腫瘤發生機制的深入認識，2015年，一種名叫“免疫療法”的腫瘤治療方式被提出，并且隨著近年來的發展徹底改變了腫瘤治療的格局，成為對抗腫瘤的有力武器。其中，免疫療法的主力軍T細胞遷移至腫瘤是抗腫瘤免疫治療領域中改善免疫治療療效的主要策略之一。

在T細胞腫瘤免疫循環過程中，促進T細胞向腫瘤遷移在抗腫瘤免疫中發揮重要作用，然而T細胞遷移到腫瘤的能力是否受到基因調控仍缺乏報道。揭示影響T細胞向腫瘤遷移的基因調控網絡對促進抗腫瘤免疫治療領域的發展至關重要。然而一個主要的挑戰是如何對驅動T細胞向腫瘤遷移的調控基因進行系統性分析。迄今為止，沒有文獻報道過如何對T細胞向腫瘤遷移的調控因子進行篩選，因此開發一種免疫細胞向腫瘤遷移的負調控因子的體外篩選、鑒定方法成為重中之重。

發明內容

本發明的目的是提供一種免疫細胞向腫瘤遷移的負調控因子的體外篩選、鑒定方法。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種免疫細胞向腫瘤遷移的負調控因子的體外篩選、鑒定方法，所述的篩選方法包括：

步驟1、采用SLICE技術對免疫細胞進行基因組編輯；

步驟2、采用嘌呤霉素puro篩選穩定表達的經基因組編輯的免疫細胞并進行擴增培養；

步驟3、將擴增培養后的經基因組編輯的免疫細胞在驅動劑的作用下進行Transwell遷移實驗，分別收集Transwell上室和下室中的細胞，比較基因未敲除和基因敲除后的遷移效率變化和/或提取基因組DNA，通過PCR擴增基因組中的sgRNA所對應的DNA序列，并對擴增后的DNA序列進行二代測序。

優選地，所述的免疫細胞為T細胞。

優選地，所述的驅動劑為趨化因子、腫瘤細胞的培養上清液或實體瘤中的一種或多種。

進一步優選地，所述的驅動劑為趨化因子CXCL9和/或趨化因子CXCL10，在經基因組編輯的T細胞表面的CXCR3表達水平最高的時段內進行Transwell遷移實驗。

在本研究中，發明人大膽設想了一種鑒定T細胞向腫瘤遷移的負調控因子的體外篩選平臺：分別以趨化因子CXCL9/10、后期將要用到的腫瘤細胞的培養上清液、甚至是人的腫瘤等作為“驅動劑”，利用Transwell遷移實驗，讓已經分別被敲除不同基因的混合T細胞向加入了普通培養基的下室以及向加入了含上述“驅動劑”的培養基中遷移，最后分別收集未發生遷移和遷移到培養基中的細胞，分別提取基因組DNA，通過PCR擴增基因組中的sgRNA所對應的DNA序列，并對擴增后的DNA序列進行二代測序。PCR產物屬于堿基不平衡文庫，為了減少堿基不平衡對測序結果的影響，測序時混入5%的phix文庫。測序采用 Hiseq Xten-PE150 策略，測序數據量要求不低于1000個拷貝的文庫sg RNA 序列數，最終數據量為2Gclean data/文庫。 測序過程由北京諾禾致源生物有限公司完成。在python中分析實驗組較對照組sgRNA富集的序列與對應的基因。