[發明專利]一種高響應度生物體反轉錄DNA合成酶活性的分析方法

在審

• 申請號: 202210132169.7
• 申請日: 2022-02-14
• 公開（公告）號: CN115521970A
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 朱灝
• 申請（專利權）人: 華夏源細胞工程集團股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12Q1/686;C12Q1/6806
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種高響應度生物體反轉錄DNA合成酶活性的分析方法及其應用。具體步驟包括：S1.裂解待測細胞，得到樣本；S2.反轉錄樣本，得到待測產物；S3.反轉錄陽性對照物，得到對照產物；S4.測定待測產物和對照產物的熒光信號；S5.根據測定結果評估待測細胞的端粒酶活性。本發明通過提供一種高響應度生物體反轉錄DNA合成酶活性的分析方法，解決了現有技術中端粒酶活性的檢測方法靈敏度低、結果可靠性差的問題，實現了對低活性(＜3％)人間充質干細胞端粒酶的有效檢測，檢測結果可信度高，經濟省時，利于臨床推廣的端粒酶活性的檢測方法。

技術領域

本發明涉及IPC C12Q1/48，尤其涉及一種高響應度生物體反轉錄DNA合成酶活性的分析方法及其應用。

背景技術

端粒酶活性的基本檢測方法——端粒重復序列延伸法最早由Greider在1985年提出，通過細胞提取液與寡核苷酸引物的保溫，活性端粒酶利用所提供的原料以自身的RNA為模板在引物的3’端添加DNA序列，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影顯示結果。但是該方法靈敏度較底，所需樣品量大，對于將端粒酶應用于臨床早期診斷和治療仍有較大局限。目前改良后端粒酶活性的檢測方法有TRAP法，TRAP銀染法，TRAP-溴化乙錠法，TRAP-雜交保護法，TRAP-酶聯免疫吸附測定法等，但是這些檢測方法往往存在著檢測樣品范圍有限、檢測時間相對較長以及檢測成本相對較高等問題，基于此，探究一種可信度、靈敏度高，經濟省時，利于臨床推廣的端粒酶活性的檢測方法成為本領域亟待解決的問題。

發明內容

本發明通過提供一種高響應度生物體反轉錄DNA合成酶活性的分析方法，解決了現有技術中端粒酶活性的檢測方法靈敏度低、結果可靠性差的問題，實現了一種可信度、靈敏度高，經濟省時，利于臨床推廣的端粒酶活性的檢測方法。

為了解決上述問題，本發明第一方面提供了一種高響應度生物體反轉錄DNA合成酶活性的分析方法，具體步驟包括：

S1.裂解待測細胞，得到樣本；

S2.反轉錄樣本，得到待測產物；

S3.反轉錄陽性對照物，得到對照產物；

S4.測定待測產物和對照產物的熒光信號；

S5.根據測定結果評估待測細胞的端粒酶活性。

在一些優選的實施方式中，所述S1步驟具體為，將待測細胞和裂解液混合，分散，裂解反應，得到樣本。

在一些優選的實施方式中，所述裂解的溫度為-10～0℃，裂解時間為15-40min。

在一些優選的實施方式中，所述裂解液的加入量為15-25μL/10⁶個待測細胞。

在一些優選的實施方式中，所述裂解液的原料包括，按照體積份計，0.5-1.5份磺酰氟化物，0.1-2份抗氧化劑，160-200份溶劑。

進一步優選，所述酶抑制劑的溶質為苯甲基磺酰氟，溶劑為裂解緩沖液；PMSF的摩爾濃度為0.01-0.03mol/L。

進一步優選，所述抗氧化劑的溶質為β-硫基乙醇，溶劑為裂解緩沖液；β-硫基乙醇的摩爾濃度為0.001-0.01mol/L。

進一步優選，所述溶劑為裂解緩沖液；裂解緩沖液可為市售，例如。

在一些優選的實施方式中，所述S2步驟具體為，將樣本加入反應液A中進行反轉錄反應，反轉錄溫度為35-40℃；反轉錄時間為2.6-3.2h。

在一些優選的實施方式中，所述樣本和反應液A的體積比為1：35-45。