[發明專利]一種具備B譜系分化潛能的人造血祖細胞的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 202210131437.3
• 申請日: 2022-02-11
• 公開（公告）號: CN114181968B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 王金勇;張琪;夏成祥;王瑤;王童潔;翁啟童;林云輕;朱艷平
• 申請（專利權）人: 北京干細胞與再生醫學研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/12;C12N5/10;C12N5/0789;A61K35/28;A61P35/00;A61P37/02;A61P31/00;A61P7/04;A61P43/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 劉二艷

本發明提供了一種具備B譜系分化潛能的人造血祖細胞的制備方法及其應用，所述制備方法包括：將RUNX1、HOXA9和LHX2三個轉錄因子同時或者分別導入人多能干細胞誘導分化體系的細胞，并進行誘導表達與誘導分化，得到所述具備B譜系分化潛能的人造血祖細胞；所述人多能干細胞誘導分化體系的細胞包括人多能干細胞、中胚層細胞、生血內皮細胞或造血祖細胞中的任意一種或至少兩種的組合；所述誘導分化的方法包括基于基質細胞共培養的單層培養誘導分化方法或類器官三維培養誘導分化方法。所述制備方法具有良好的誘導及分化效率，制備得到的細胞的活性好、分化能力高，具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于免疫學技術領域，尤其涉及一種具備B譜系分化潛能的人造血祖細胞的制備方法及其應用。

背景技術

B細胞是人體體液免疫系統的關鍵細胞成分，B細胞功能低下或缺陷的患者，比如老年人或者有基礎疾病的患者，將會導致體液免疫受損，甚至出現嚴重的病原體感染。此外，基因工程改造的B細胞（engineering B cells）在臨床上的抗感染、抗腫瘤以及疾病治療領域有非常可觀的應用前景。

然而，臨床上B細胞以及B細胞衍生的丙種球蛋白制劑等藥物來源于人體的外周血或者骨髓庫，資源有限，制備耗時較長，成本較高。多能干細胞（pluripotent stem cells，PSCs）是一類具有無限增殖潛能、多譜系分化潛力、方便進行基因編輯修飾的細胞，是細胞療法再生醫學研究的熱點。因此，實現多能干細胞誘導人B細胞種子再生將有望造福眾多體液免疫系統異常的患者，極大地推動基因工程改造的B細胞療法的應用。但是，目前關于多能干細胞誘導人B細胞再生的研究報道非常少，迄今為止沒有實質性進展與突破，更沒有臨床轉化的案例。這說明B細胞再生領域還有很高的壁壘需要克服。

研究表明，人多能干細胞在體外與基質細胞共培養可以依次誘導出造血祖細胞、B祖細胞以及CD19⁺sIgM⁺B細胞（French, Anna et al. Human induced pluripotent stemcell-derived B lymphocytes express sIgM and can be generated via a hemogenicendothelium intermediate. Stem cells and development vol. 24,9 (2015): 1082-95.）。但是體外無法誘導產生成熟的B細胞，且體外誘導的方式耗時較長、效率較低。直接從體外誘導出有功能、成熟的人B細胞的技術方法存在很大的困難，因此研究人員開始考慮通過體內移植的方式實現人B細胞再生。

目前僅有少量關于體內B細胞再生的研究，主要是通過體外誘導多能干細胞誘產生B祖細胞，再將其移植入動物模型中實現B細胞再生。但是存在以下的問題：第一，B細胞在體內存在的時間很短暫，同時在移植后6~8周后就檢測不到分泌的抗體（Potocnik, A J etal. Reconstitution of B cell subsets in Rag deficient mice by transplantationof in vitro differentiated embryonic stem cells. Immunology letters vol. 57,1-3 (1997): 131-7）；第二，不能獲得對適應性體液免疫應答更重要的B2細胞（Lin, Yanget al. Long-Term Engraftment of ESC-Derived B-1 Progenitor Cells SupportsHSC-Independent Lymphopoiesis. Stem cell reports vol. 12,3 (2019):572-583）。以上研究表明，多能干細胞體外誘導B祖細胞以及B祖細胞移植后進行體內B細胞再生的系統存在一定的缺陷，推測可能缺乏了特定的轉錄因子導致再生的B淋巴細胞譜系存在一定的缺陷。