[發(fā)明專利]一種具備B譜系分化潛能的人造血祖細胞的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210131437.3
• 申請日: 2022-02-11
• 公開（公告）號: CN114181968B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王金勇;張琪;夏成祥;王瑤;王童潔;翁啟童;林云輕;朱艷平
• 申請（專利權(quán)）人: 北京干細胞與再生醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/12;C12N5/10;C12N5/0789;A61K35/28;A61P35/00;A61P37/02;A61P31/00;A61P7/04;A61P43/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 劉二艷

1.一種具備B譜系分化潛能的人造血祖細胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：

將RUNX1、HOXA9和LHX2三個轉(zhuǎn)錄因子同時或者分別導(dǎo)入人多能干細胞誘導(dǎo)分化體系的細胞，并進行誘導(dǎo)表達與誘導(dǎo)分化，得到所述具備B譜系分化潛能的人造血祖細胞；

所述人多能干細胞誘導(dǎo)分化體系的細胞為人誘導(dǎo)性多能干細胞、中胚層細胞、生血內(nèi)皮細胞或造血祖細胞中的任意一種或至少兩種的組合；

所述轉(zhuǎn)錄因子的導(dǎo)入的方法包括基因過表達、內(nèi)源基因激活或基因編輯中的任意一種或至少兩種的組合；

所述誘導(dǎo)分化的方法為基于基質(zhì)細胞共培養(yǎng)的單層培養(yǎng)誘導(dǎo)分化，包括三個階段：誘導(dǎo)人多能干細胞產(chǎn)生中胚層細胞、誘導(dǎo)生血內(nèi)皮細胞分化和誘導(dǎo)造血祖細胞分化和成熟；

所述誘導(dǎo)人多能干細胞產(chǎn)生中胚層細胞中使用D0培養(yǎng)基和D1培養(yǎng)基；

所述誘導(dǎo)生血內(nèi)皮細胞分化中使用D2培養(yǎng)基；

所述誘導(dǎo)造血祖細胞分化和成熟中使用D9培養(yǎng)基和/或D16培養(yǎng)基；

所述D0培養(yǎng)基包括人堿性成纖維細胞生長因子、重組人活化素、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、GSK-3α/β抑制劑CHIR99021、PI3K抑制劑LY294002和TeSR-E6培養(yǎng)基；

所述D1培養(yǎng)基包括重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、ALK5抑制劑A83-01、Wnt通路抑制劑IWR-1-endo和TeSR-E6培養(yǎng)基；

所述D2培養(yǎng)基包括維生素C、重組人FMS樣酪氨酸激酶3配體、人堿性成纖維細胞生長因子、人血管內(nèi)皮生長因子、重組人干細胞因子、重組人白介素3、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、丁酸鈉和StemPro-34培養(yǎng)基；

所述D9培養(yǎng)基包括重組人促血小板生成素、重組人白介素3、重組人干細胞因子、重組人白介素11、人胰島素樣生長因子1、人血管內(nèi)皮生長因子、人堿性成纖維細胞生長因子、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、重組人FMS樣酪氨酸激酶3配體、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、強力霉素和StemPro-34培養(yǎng)基；

所述D16培養(yǎng)基包括血清替代物B27、ROCK抑制劑Y-27632、重組人促血小板生成素、重組人干細胞因子、重組人白介素3、重組人FMS樣酪氨酸激酶3配體、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、強力霉素和StemPro-34培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具備B譜系分化潛能的人造血祖細胞的制備方法，其特征在于，所述RUNX1、HOXA9和LHX2三個轉(zhuǎn)錄因子同時或分別進行誘導(dǎo)表達，所述誘導(dǎo)表達開始于中胚層細胞、生血內(nèi)皮細胞或造血祖細胞。

3.權(quán)利要求1或2所述的具備B譜系分化潛能的人造血祖細胞的制備方法在制備藥物組合物中的應(yīng)用。