[發明專利]一種基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原體檢測系統及其應用

在審

• 申請號: 202210128562.9
• 申請日: 2022-02-11
• 公開（公告）號: CN114395636A
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 郝文波;黃穎而;陳佳靈
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 李瑞雨

本發明公開了一種基于RPA?CRISPR/Cas12a的人型支原體檢測系統及其應用，涉及微生物檢測領域；所述檢測系統包括RPA擴增引物對、探針、crRNA和AsCas12a蛋白；所述RPA擴增引物對為如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列；所述探針的序列為SEQ ID NO:16所示序列；所述crRNA為SEQ ID NO:10?12任一項所示序列。本發明基于該RPA?CRISPR/Cas12a檢測系統構建的三種快速核酸檢測人型支原體的方法增加了檢測的靈敏度，并且本發明方法顯示出具有極高的特異性，為人型支原體的檢測提供了新的技術平臺。

技術領域

本發明涉及微生物檢測領域，特別是涉及一種基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原體檢測系統及其應用。

背景技術

支原體是體積最小，能自我復制的原核生物。其中較多感染包括解脲脲原體和人型支原體。人型支原體(Mycoplasma homini,M.homini)是泌尿生殖道感染的主要病原體之一，主要通過分解精氨酸產生氨，對宿主細胞造成免疫刺激和人體危害，引起泌尿生殖道和外生殖道感染。尤其發生在女性患者中，能夠引起女性陰道炎、產道感染等疾病。國內外學者發現，隨著人類性意識的開放，抗生素的不規范使用，臨床檢測技術相對落后等，造成部分患者確診困難，影響后續治療效果。

在人型支原體的檢測鑒定方法研究方面，從傳統的形態學鑒定到分子檢測技術均有報道。目前人型支原體檢測主要采用液體培養法和金標準固體培養法。而相較于其他生殖道相關的病原體，人型支原體無細胞壁，生長緩慢，對培養鑒定要求及其嚴格，使得分離培養較為困難，費時費力。qPCR是一種高靈敏高特異性的核酸檢測技術，但這種方法需要專業人員操作以及需要復雜的儀器設備，并不是所有的實驗室都具備這樣的檢測條件，且耗時長，成本高，從而阻礙該檢測方法的大范圍推廣。因此，建立一種快速，便捷，靈敏的實驗室診斷方法極其必要。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)規律成簇間隔短回文重復序列以及Cas(CRISPR-associated proteins)CRISPR相關聯蛋白構成CRISPR/Cas系統。研究者發現CRISPR/Cas系統不僅具有基因編輯能力，還可用于基因診斷。隨著對CRISPR/Cas系統的深入研究，已有多種CRISPR/Cas系統被開發為快速、靈敏的核酸檢測技術。其中II類Cas蛋白具有“附帶切割”特性，在核酸檢測上具有巨大的應用潛能和研究開發價值。以張鋒團隊發現的II類V型Cas12a蛋白為例，在crRNA引導下，Cas12a蛋白能夠特異性識別目標ssDNA并切割，伴隨附帶切割功能，激活非特異性ssDNA的斷裂能力。基于該原理，借助DNA探針這種非特異的ssDNA片段加入，通過熒光信號的釋放提示靶標基因存在，從而推斷樣品中是否含有待檢的病原體。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原體檢測系統及其應用，以解決上述現有技術存在的問題，本發明采用CRIAPR/Cas12a系統、RPA(重組酶聚合酶擴增技術)、熒光實時監測、側流層析技術相結合的方法，實現人型支原體的檢測，解決了人型支原體篩查的問題。

為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

本發明提供一種基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原體檢測系統，所述檢測系統包括RPA擴增引物對、探針、crRNA和AsCas12a蛋白；

所述RPA擴增引物對為如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列；

所述探針的序列為SEQ ID NO:16所示序列；

所述crRNA為SEQ ID NO:10-12任一項所示序列。