[發明專利]一種基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原體檢測系統及其應用

在審

• 申請號: 202210128562.9
• 申請日: 2022-02-11
• 公開（公告）號: CN114395636A
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 郝文波;黃穎而;陳佳靈
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 李瑞雨

1.一種基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原體檢測系統，其特征在于，所述檢測系統包括RPA擴增引物對、探針、crRNA和AsCas12a蛋白；

所述RPA擴增引物對的序列為如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列；

所述探針的序列為SEQ ID NO:16所示序列；

所述crRNA的序列為SEQ ID NO:10-12任一項所示序列。

2.根據權利要求1所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原體檢測系統，其特征在于，所述crRNA的制備方法為：先按照SEQ ID NO:7-9任一項所示的DNA單鏈制備DNA體外轉錄模板，再根據所述DNA體外轉錄模板轉錄制備得到所述crRNA；其中，SEQ ID NO:10所示crRNA按照SEQ ID NO:7所示的DNA單鏈制備得到，SEQ ID NO:11所示crRNA按照SEQ ID NO:8所示的DNA單鏈制備得到，SEQ ID NO:12所示crRNA按照SEQ ID NO:9所示的DNA單鏈制備得到。

3.根據權利要求1所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原體檢測系統，其特征在于，所述crRNA的序列為SEQ ID NO:12所示序列。

4.根據權利要求1-3任一項所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原體檢測系統在制備檢測人型支原體的試劑盒中的應用。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述試劑盒檢測人型支原體的方法包括以下步驟：

(1)以待測菌的基因組DNA為模板，采用所述的RPA擴增引物對進行RPA擴增，得到RPA擴增產物；

(2)配制CRISPR/Cas12a反應液，所述CRISPR/Cas12a反應液包括所述的探針、crRNA和AsCas12a蛋白，以及步驟(1)制備的RPA擴增產物；所述探針一端標記FAM，另一端標記BHQ；

(3)利用步驟(2)制備的CRISPR/Cas12a反應液進行CRISPR/Cas12a反應，之后對熒光強度進行檢測。

6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述試劑盒檢測人型支原體的方法包括以下步驟：

(1)以待測菌的基因組DNA為模板，采用所述的RPA擴增引物對進行RPA擴增，得到RPA擴增產物；

(2)配制CRISPR/Cas12a反應液，所述CRISPR/Cas12a反應液包括所述的探針、crRNA和AsCas12a蛋白，以及步驟(1)制備的RPA擴增產物；所述探針一端標記FITC，另一端標記Biotin；

(3)利用步驟(2)制備的CRISPR/Cas12a反應液進行CRISPR/Cas12a反應，之后用膠體金側流層析試紙條進行檢測。

7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述試劑盒檢測人型支原體的方法包括以下步驟：

(1)以待測菌的基因組DNA為模板，采用所述的RPA擴增引物對進行RPA擴增，得到RPA擴增產物；

(2)配制CRISPR/Cas12a反應液，所述CRISPR/Cas12a反應液包括所述的探針、crRNA和AsCas12a蛋白，以及步驟(1)制備的RPA擴增產物；所述探針一端標記FITC，另一端標記Biotin；

(3)利用步驟(2)制備的CRISPR/Cas12a反應液進行CRISPR/Cas12a反應，之后用時間分辨銪標微球免疫層析試紙條進行檢測。

8.一種檢測人型支原體的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1-3任一項所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原體檢測系統。

9.根據權利要求8所述的檢測人型支原體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括膠體金側流層析試紙條或時間分辨銪標微球免疫層析試紙條。

10.根據權利要求8所述的檢測人型支原體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒通過檢測熒光強度顯示檢測結果。