[發(fā)明專利]基于CRISPR檢測(cè)腦卒中相關(guān)TYMS基因的試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210128252.7
• 申請(qǐng)日: 2022-02-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114438192A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖以磊;于福華;孫漢宇;劉岳飛;周杰;邢曉輝;李中辰;程誠(chéng);姚杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇博嘉生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12N15/11;C12Q1/686
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 姜婷

本發(fā)明屬于基因突變檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了基于CRISPR檢測(cè)腦卒中相關(guān)TYMS基因的試劑盒，所述試劑盒包括針對(duì)TYMS基因rs699517和rs2790位點(diǎn)設(shè)計(jì)的突變型crDNA或突變型crRNA，其序列如SEQ ID NO.1～4所示，結(jié)合CRISPR?cas12a系統(tǒng)，能確定待測(cè)樣本中是否存在TYMS基因rs699517和/或rs2790位點(diǎn)的基因突變，具備特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因突變檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于CRISPR檢測(cè)腦卒中相關(guān)TYMS基因突變的試劑盒。

背景技術(shù)

腦卒中又稱中風(fēng)，是一種復(fù)雜的多因素多基因疾病，由多種基因-基因和基因-環(huán)境相互作用引起。多種因素包括高血壓、糖尿病、吸煙、高脂血癥和高同型半胱氨酸血癥，都與較高的中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。特別是高同型半胱氨酸血癥，被認(rèn)為是多民族缺血性中風(fēng)的一個(gè)獨(dú)立的、潛在的可改變的危險(xiǎn)因素。研究表明，高血壓、空腹血糖受損和高同型半胱氨酸血癥被認(rèn)為是腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而這種風(fēng)險(xiǎn)的分子基礎(chǔ)歸因于葉酸循環(huán)、蛋氨酸循環(huán)和胸苷酸合成酶(DNA修復(fù))中因子的異常功能，這些因子參與單碳代謝。例如，同型半胱氨酸(Hcy)和亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)直接參與蛋氨酸的合成，并導(dǎo)致與高同型半胱氨酸血癥相關(guān)的腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。

最近，有研究調(diào)查了葉酸與中風(fēng)的關(guān)系，在隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中，葉酸攝入有助于預(yù)防中風(fēng)。因此，腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)受Hcy和葉酸的影響，葉酸是預(yù)防血管疾病的候選營(yíng)養(yǎng)素。胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase，TYMS)是參與葉酸代謝的酶之一。具體而言，TYMS分別催化5,10-亞甲基四氫葉酸(THF)和脫氧尿苷單磷酸(dUMP)轉(zhuǎn)化為5-甲基THF-脫氧胸苷單磷酸(dTMP)。這種轉(zhuǎn)化需要5,10-甲基THFA作為底物來(lái)生成胸苷(dTMP)，這是DNA合成和修復(fù)所需的核苷酸。因此，TYMS在葉酸代謝中起著至關(guān)重要的作用，而葉酸代謝是DNA合成和修復(fù)的關(guān)鍵組成部分。編碼這些因子的基因異常可導(dǎo)致多種問(wèn)題，包括MTHFR降低和胸苷酸合成酶(TS)水平升高，這可能通過(guò)同型半胱氨酸積累、葉酸缺乏或兩者兼而有之導(dǎo)致心血管疾病。

由于TYMS參與DNA修復(fù)機(jī)制，TYMS基因的遺傳變異已在癌癥治療學(xué)中被報(bào)道和研究。此外，TYMS基因多態(tài)性已在血管疾病中進(jìn)行了研究，并顯示與疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。并且TYMS基因多態(tài)性對(duì)缺血性卒中和SBI易感性及進(jìn)展的影響也已被研究。研究表明TYMS多態(tài)性(1100TC[rs699517]、1170AG[rs2790]])與缺血性中風(fēng)和無(wú)癥狀性腦梗塞(SBI)的相關(guān)性。

現(xiàn)階段臨床一般通過(guò)定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)(Quantitative real timepolymerase chain reaction，Q-PCR)、非放射性原位雜交技術(shù)(fluorescence insituhybridization，F(xiàn)ish)、多重引物PCR(multiplex PCR)等方式對(duì)患者進(jìn)行基因突變檢測(cè)，然而這些檢測(cè)技術(shù)均存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)過(guò)程復(fù)雜或檢測(cè)成本過(guò)高等問(wèn)題，導(dǎo)致無(wú)法應(yīng)用到大規(guī)模的臨床樣本研究中。因此亟需提供一種溫度控制簡(jiǎn)單，且靈敏度、特異性高的特異性片段檢測(cè)方法。

RNA引導(dǎo)的成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列-CRISPR(CRISPR-Cas)相關(guān)方法由于其高可靠性和特異性而在快速核酸檢測(cè)方面顯示出相當(dāng)大的前景。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種類型的Cas核酸酶用于CRISPR-Cas系統(tǒng)，例如Cas9、Cas12等。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本過(guò)高和準(zhǔn)確性不高以致無(wú)法大規(guī)模檢測(cè)臨床樣本基因突變的問(wèn)題，提供了一種基于CRISPR技術(shù)檢測(cè)與腦卒中相關(guān)的TYMS基因是否存在rs699517和/或rs2790目標(biāo)突變位點(diǎn)和檢測(cè)該靶核酸在目標(biāo)區(qū)域是否存在突變的試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體采用以下技術(shù)方案：

一種檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括突變型crDNA或突變型crRNA；