[發明專利]用于鑒定炮制輔料鱉血的特異性引物對、試劑盒及應用

有效

• 申請號: 202210127758.6
• 申請日: 2022-02-11
• 公開（公告）號: CN114672571B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 陸兔林;趙曉莉;毛春芹;毛靖;許金國;蘇雪蓉;謝穎;婁悅
• 申請（專利權）人: 南京中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11;C12Q1/686
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 尹妍;徐蓓

本發明涉及用于鑒定炮制輔料鱉血的特異性引物對、試劑盒及應用，該特異性引物對由正向引物和反向引物組成，其正向引物核苷酸序列為：CTAGCAACCTAGCCCATGTG；反向引物核苷酸序列為：GGATCTCCTCCTCCAGAAGG。本發明還提供前述特異性引物對在鱉血鑒定中的應用。本發明的特異性引物對特異性好，只需要在一個反應體系內進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增反應，僅1?h即能快速、準確鑒定炮制輔料鱉血和其他動物血液，并能實現鱉血與其他動物的鑒別，為鱉血提供完善、客觀、穩定、準確、科學可靠的鑒定方法。

技術領域

本發明涉及生物制品鑒定及分子標記技術領域，尤其涉及用于鑒定炮制輔料鱉血的特異性引物對、試劑盒及應用。

背景技術

鱉血系鱉科動物中華鱉(Trionyx?sinensis?Wiegmann)的新鮮血液，由于鱉血具有滋陰清熱、活血通絡的功效，因此被廣泛記載并應用于中國傳統醫藥中。通過對歷代本草典籍的考證發現，鱉血除直接藥用之外，還是一種具有中藥傳統特色的炮制輔料，用以填血滋陰，抑制藥物浮陽之性，增強清肝退熱之效，主要用于炮制柴胡、胡黃連、黃連、青蒿、甘草節等飲片，并應用于方劑中，其中鱉血柴胡飲片作為江西樟幫特色炮制方法沿用至今。據文獻記載，每100kg柴胡藥材炮制需要活鱉200個，即近6L鱉血。鱉血藥效顯著但量少難取，目前鱉血作為中藥炮制輔料的質量標準尚缺乏專屬性鑒別，而血液類藥材存在以豬血牛血等量大易得動物血液摻偽現象，并且不同種屬動物血液僅從形態上難以區分。炮制輔料鱉血基原無從保證，直接影響用其作為輔料炮制的中藥飲片的質量及其臨床用藥的安全性和有效性，因此急需一系列專屬性強、科學可靠的檢測鱉血輔料的方法。傳統的性狀鑒定方法易受采集加工、儲存等因素影響，性狀差異較大，主觀性較強；使用單一成分鑒定具有局限性，同時近緣物種的化學成分差異較小，不易直接觀察。

特異性PCR鑒別技術基于物種DNA序列，通過設計具有物種特異性的引物，進行聚合酶鏈式反應擴增出目標條帶從而進行物種鑒別，具有分析速度快、結果準確的優點。目前聚合酶鏈式反應法(PCR)已經納入2020版《中國藥典》，而目前對炮制輔料鱉血完整的科學鑒定方法，特別在炮制輔料鱉血的分子生物學、生物化學方面的特征性鑒定尚無依據可詢，因此用高科技建立鱉血產品的分子生物學、生物化學方面的特征性鑒定手段，成為當前緊要任務。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是根據樣品中蛋白質分子量大小的不同，使其在電泳膠中分離。經文獻查證和試驗研究，不同種屬樣品在蛋白條帶數目、大小上均不相同，同種屬樣品在蛋白條帶數目、大小上保持一致，可有效鑒別炮制輔料鱉血質量。

發明內容

本發明的目的在于提供用于鑒定炮制輔料鱉血的特異性引物對及其應用，為輔料鱉血的真偽提供科學可靠的鑒定方法。

為實現上述技術目的，本發明采用如下技術方案：

一種用于鑒定炮制輔料鱉血的特異性引物對，

正向引物核苷酸序列為：CTAGCAACCTAGCCCATGTG；

反向引物核苷酸序列為：GGATCTCCTCCTCCAGAAGG。

本發明的另一目的在于提供上述特異性引物對在制備用于鑒定炮制輔料鱉血的試劑盒中的應用。

本發明的又一目的在于提供一種用于鑒定炮制輔料鱉血的試劑盒，所述試劑盒包含所述特異性引物對。

作為一種優選的實施方式，所述試劑盒，還包括PCR反應的試劑。

本發明的再一目的在于提供上述特異性引物對在鑒定炮制輔料鱉血中的應用。

作為一種優選的實施方式，上述應用包括：提取待鑒定樣品基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，使用所述特異性引物進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行電泳檢測，在286bp處檢測出條帶的樣品鑒定為鱉血，在286bp處未檢測出條帶的樣品鑒定為其他動物血液。