[發(fā)明專利]一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒II型的CDA引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210124318.5
• 申請(qǐng)日: 2022-02-10
• 公開（公告）號(hào): CN114381554A
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 毛瑞;趙月;蔡挺
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國科寧波生命與健康產(chǎn)業(yè)研究院;中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 上海碩力知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31251
• 代理人: 王法男

本發(fā)明涉及一種基于閉合頸環(huán)介導(dǎo)的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Closed Dumbbell mediated Isothermal Amplification ofnucleic acids，CDA)的引物對(duì)用于豬圓環(huán)病毒II型的快速檢測(cè)。本發(fā)明公開了一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒II型的CDA引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用。所述CDA引物對(duì)為針對(duì)豬圓環(huán)病毒II型的保守區(qū)片段擴(kuò)增的引物，為PCV2?MF/PCV2?MR；其中，PCV2?MF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PCV2?MR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明提供的方法無需昂貴的儀器、也無需復(fù)雜的操作即可完成對(duì)豬圓環(huán)病毒II型的快速準(zhǔn)確檢測(cè)，因此，適用于專業(yè)程度不高的海關(guān)、養(yǎng)殖場(chǎng)等地的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒II型的CDA引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)感染為二類傳染病、是豬的一種常發(fā)病毒性感染疾病，由豬圓環(huán)病毒引起的豬的一種新的傳染病。本病可導(dǎo)致豬群產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制，從而容易導(dǎo)致繼發(fā)或并發(fā)其他傳染病。豬圓環(huán)病毒2型的危害在于能夠使感染豬只的免疫功能受到損害，這種可導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制的病毒，由于經(jīng)常以亞臨床感染的形式出現(xiàn)，常易被忽視。為了更好地控制豬圓環(huán)病毒的感染，迫切需要尋找一種適合的快速準(zhǔn)確的診斷方法。

目前對(duì)于PCV2的免疫學(xué)診斷方法的研究較少，難于適用PCV2的早期疫情防控。在分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)中，經(jīng)典的PCR技術(shù)在各種病原檢測(cè)中得到了廣泛的運(yùn)用。現(xiàn)有的檢測(cè)方法主要包括PCR、DNA探針技術(shù)等。盡管這些技術(shù)能快速檢測(cè)樣品中總的或致病性豬圓環(huán)病毒II型的數(shù)量，但這些方法依賴于特殊而昂貴的設(shè)備，且其操作過程復(fù)雜費(fèi)時(shí)(包括DNA的分離、雜交、比色以及探針和引物的合成等)，只有熟練掌握其操作技巧的技術(shù)人員才能完成測(cè)試。因此，以上針對(duì)核酸分子的方法并不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，建立一種快速、靈敏、特異的豬圓環(huán)病毒II型核酸檢測(cè)方法迫在眉睫。

基于閉合頸環(huán)介導(dǎo)的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Closed Dumbbell mediatedIsothermal Amplification ofnucleic acids，CDA)是國科寧波生命與健康產(chǎn)業(yè)研究院開發(fā)的替代日本LAMP核酸擴(kuò)增的方法(中國發(fā)明專利號(hào)：ZL202110473121.8)。該方法主要利用2種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的特定區(qū)域，在恒溫條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)基因檢測(cè)手段(如PCR等)相比，CDA反應(yīng)在恒溫水浴箱中便可完成，儀器設(shè)備要求低，較傳統(tǒng)PCR和培養(yǎng)法操作簡單許多，不需要專業(yè)人士也可準(zhǔn)確完成，且擴(kuò)增結(jié)果可結(jié)合金屬離子指示劑羥基萘酚蘭(HNB)，通過肉眼觀察顏色變化以實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的判斷，使其適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)及地方檢驗(yàn)檢疫部門。并且，CDA還可以大大縮短操作時(shí)間，減少樣品污染機(jī)會(huì)，適合應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒II型的快速診斷。此外，CDA所用關(guān)鍵成環(huán)引物約為30bp，較LAMP中成環(huán)引物40bp短，這將極大程度的節(jié)約成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒II型的CDA引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案如下：

一種非疾病診斷目的的檢測(cè)豬圓環(huán)病毒II型的CDA引物對(duì)，所述CDA引物對(duì)為PCV2-MF/PCV2-MR，其中，PCV2-MF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PCV2-MR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒II型的試劑盒，所述試劑盒包括上述的CDA引物對(duì)。

作為優(yōu)選實(shí)施方案，所述CDA引物對(duì)中，引物PCV2-MF與PCV2-MR的濃度均為1～2μM。

作為優(yōu)選實(shí)施方案，所述試劑盒還包括Bst聚合酶、CDA反應(yīng)緩沖液、超純水以及顯色劑。

作為優(yōu)選實(shí)施方案，所述顯色劑選自SYBR green I、Eva green、羥基萘酚藍(lán)、鉻黑T中的一種。