[發明專利]一種人精子膜蛋白SPACA1特異性抗原偶聯蛋白與抗體的制備方法

在審

• 申請號: 202210120812.4
• 申請日: 2022-02-09
• 公開（公告）號: CN114395028A
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 王江;牛遠杰;李剛;郭戰軍;沈沖;劉子豪;陳昱彤;米洪霖;辛鐘成
• 申請（專利權）人: 天津市泌尿外科研究所
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K19/00;C07K16/18;C07K16/06;G01N33/68
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 林玉慧

一種人精子膜蛋白SPACA1特異性抗原偶聯蛋白與抗體的制備方法。N端特異性多肽氨基酸序列為：NYAPPETEDVSNRNC。抗人精子膜蛋白SPACA1抗體制備包括：（1）特異性胞外抗原表位分析與設計；(2)特異性人工多肽合成；（3）合成多肽與載體蛋白交聯；（4）制備兔多克隆抗體；（5）收集、分離、純化獲得抗體。本發明制備的特異性抗人精子膜蛋白SPACA1抗體效價高、親和力強、特異性好，可在體內和體外與具有天然活性的人精子膜蛋白SPACA1抗原表位發生特異性結合，可用于熒光免疫和酶聯免疫吸附實驗。該抗體不僅對研究人精子膜蛋白SPAG8蛋白特性、功能、表達譜和相關疾病提供一個重要工具，還在靶向示蹤、生物制藥和精準治療等領域具有應用前景。

技術領域

本發明涉及一種多肽及其抗體制備方法，該抗體是用于人精子膜蛋白SPACA1蛋白的基礎研究的重要工具，還可在靶向示蹤、生物制藥和精準治療等領域具有很好的應用前景。

背景技術

精子獲能是兩性生殖過程的重要步驟，獲能過程中精子細胞膜從非生育狀態轉化到生育狀態。當精子獲能后，精子膜蛋白、糖蛋白、脂質成分和精子質膜通道發生多種分子結構的變化，一方面出現精子頭部質膜成分損失，尾部細胞膜改變，發生精子超活化；另一方面精子對卵細胞及其相關結構(顆粒細胞，卵透明帶)提供的信號進行反饋并發生頂體反應(AR)。出現頂體受體的激活、頂體膜與精細胞質膜融合、頂體中水解酶的釋放、卵細胞外被(透明帶)的水解等過程，最終促進精子-卵母細胞融合。精子頂體區上的這些受體、糖或蛋白質分子可以作為抗原直接產生抗精子抗體(AsAb)，從而妨礙精卵融合，引發男性不育。由于缺乏精子頂體膜蛋白特異性抗原位點和抗體的研究，AsAb引起男性免疫不育癥的作用機制尚未明確，因此借助分子生物學、生物信息學和高通量測序等技術的跨學科應用，進一步揭示精子頂體區、頸部和尾部精子表面膜蛋白的特異性抗原位點在兩性生殖過程中的作用機制，構建特異性免疫不孕不育靶向治療方法等一系列的科學問題，是促進健康生育、構筑人口安全的重大需求。

(1)SPACA1的功能：人精子頂體膜相關蛋白1(sperm acrosome membrane-associated protein 1，SPACA1)基因位于6q15DNA正義鏈，長度為19,798bp，有8個外顯子，具有一個保守結構域，該基因的mRNA有兩種亞型：XM_011536160.2和XM_017011335.1。SPACA1蛋白質產物294個氨基酸，分子量32,143Da，是單次跨膜Ⅰ型膜蛋白，主要位于細胞膜。在精子發生過程中，在精子細胞發育的所有階段的頂體中都能檢測到SPACA1，但在頂體形成之前未發現。該蛋白定位于精子細胞和成熟精子的整個頂體的內膜和外膜。有研究顯示SPACA1主要在頂體形態發生和精卵結合及融合中起作用。

(2)SPACA1抗體產品的信息：經檢索,市場上有SPACA1蛋白的多克隆抗體,但是這些抗體的抗原表位不同且只能進行體外檢測。

(3)SPACA1抗體的功能：SPACA1抗體與特發性不孕不育病例具有相關性，該基因表達的蛋白最早通過不育男性的抗精子抗體識別。體外實驗顯示SPACA1在精子與卵膜結合與融合中發揮生理作用，SPACA1重組蛋白產生的抗體可以抑制人類精子與去透明帶倉鼠卵的結合從而阻斷體外受精。重組SPACA1抗原與抗精子抗體陽性的不育男性血清有強烈的免疫結合反應，提示SPACA1可能是引起免疫不育的抗原。動物實驗顯示，SPACA1蛋白在精子頭部的形成中起著重要作用，SPACA1基因敲除小鼠的成熟精子是缺乏頂體的圓頭精子能夠引起不育。

發明內容

本發明目的針對可用于免疫不育機制研究的AsAb制備方法和研究工具的不足，提供一種人精子膜蛋白SPACA1特異性多肽、抗原偶聯蛋白與抗體的制備方法，不同于體外實驗檢測抗體，用此多肽制備的抗SPACA1抗體一方面可以通過免疫熒光和酶聯免疫吸附實驗特異識別組織或細胞中的天然人SPACA1蛋白，另一方面可以借助SPACA1的特異性表面抗原位點進行抗精子抗體介導的免疫不育作用機制的研究，還可以開展靶向示蹤、生物制藥和精準治療等方面的研究。

本發明的技術方案