[發明專利]一種多譜系肝臟類器官及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202210119937.5
• 申請日: 2022-02-09
• 公開（公告）號: CN114149961B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 吳迪;葛嘯虎;曹寧;王莉莉;徐迎;王思思;李慧芳;羅曉琴
• 申請（專利權）人: 天九再生醫學（天津）科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 馬云云

本發明提供了一種多譜系肝臟類器官及其構建方法和應用，該方法采用特定的培養基，實現內胚層分化到前腸管衍生物，再到肝臟多譜系特化，最后實現肝臟類器官的藥代成熟。通過該方法構建肝臟類器官誘導周期短、培養體系相對簡單，操作難度比較小，且采用無血清誘導分化體系，被病原微生物污染的風險低。另外，該方法得到的多譜系肝臟類器官可作為高精準度藥篩模型。

技術領域

本發明涉及干細胞生物學及再生醫學領域，尤其是涉及一種多譜系肝臟類器官及其構建方法和應用。

背景技術

肝臟是人體最重要的藥物代謝器官，而藥物的肝毒是藥品下架的主要原因之一。在動物模型中，藥物清除率及肝臟毒性的相關性與臨床上的結果差異極大；而人原代肝細胞雖然作為藥物代謝的金標準，其來源的短缺使其應用大大受限，目前亟需開發一個具備較強代謝功能的體外人源肝臟代謝模型。

人多能干細胞 (hPSC) 具有增殖能力與多譜系分化潛力；可于體外定向分化為各種體細胞類型。近年來隨著再生醫學、發育學以及組織工程學的快速發展，世界各地研究者逐步建立了hPSC來源的腸、肝、腦、腎、胃等多種類器官誘導系統；與2D單層細胞相比，這些3D類器官呈現了更復雜的結構，擁有更貼近生理原貌的成熟度與功能性。而hPSC來源的肝類器官系統，被認為具備還原人類肝臟完整功能的潛力，有望成為新一代的高精準度藥篩模型。目前，構建肝臟類器官的方法相對較多，但還存在一定的缺陷，限制了肝臟類器官的應用，如體系誘導大于40天周期較長，培養體系復雜，中間階段需挑取克隆，操作難度大，且依賴動物血清，難以實現大范圍應用。

發明內容

有鑒于此，本發明旨在提出一種多譜系肝臟類器官的構建方法，將腸管前部衍物誘導分化為勻質且尺寸均一的多譜系肝前體，并將這些肝前體誘導分化為具備高藥代活性的成熟肝類器官，適用于高通量藥物篩選。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

一種多譜系肝臟類器官的構建方法，該方法包括如下步驟：

S1、誘導人多能干細胞分化形成定形內胚層；

S2、使用BMP抑制劑、FGF4、WNT信號激活劑誘導定形內胚層分化為前腸管衍生物；

S3、將前腸管衍生物消化為單細胞，依次使用TGFβ抑制劑、SIRT1抑制劑、VEGF、FGF2、WNT信號激活劑、EGF組合物與RAR核受體激動劑、SIRT1抑制劑、石膽酸LCA組合物，使前腸管單細胞增殖、分化為勻質且尺寸均一的多譜系肝類器官；

S4、使用MST1/2的抑制劑、α1-腎上腺素能受體激動劑、甲萘醌4 MK4、 cAMP激活劑、地塞米松MK125組合物實現多譜系肝類器官的藥代成熟化。

進一步，在步驟S2中，所述BMP抑制劑為CC、Noggin或LDN193189中的任一種，所述WNT信號激活劑為CHIR99021或Wnt3a；

優選地，所述BMP抑制劑為CC，用量為0.75μM；所述FGF4的濃度為250ng/ml；所述WNT信號激活劑為CHIR99021，用量為3μM。

進一步，在步驟S2中所用的培養基中包括2% Knockout血清替代物KSR、0.5%胰島素-轉鐵蛋白-硒混合液ITS、75%William's E和22.5% Ham營養混合物F12。

進一步，在步驟S3中，所述TGFβ抑制劑為RepSox、A83-01或SB431542中的任一種，所述SIRT1抑制劑為NIC，所述WNT信號激活劑為Wnt3a或CHIR99021，所述RAR核受體激動劑為全反式維甲酸ATRA；