[發明專利]一種多譜系肝臟類器官及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202210119937.5
• 申請日: 2022-02-09
• 公開（公告）號: CN114149961B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 吳迪;葛嘯虎;曹寧;王莉莉;徐迎;王思思;李慧芳;羅曉琴
• 申請（專利權）人: 天九再生醫學（天津）科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 馬云云

1.一種多譜系肝臟類器官的構建方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

S1、誘導人多能干細胞分化形成定形內胚層；

S11、將人多能干細胞在添加有重組人激活素A、重組人骨形態發生蛋白4（rhBMP4）和GSK-3抑制劑CHIR99021的RPMI-1640培養基中培養1天；

S12、再將S11步驟中得到的細胞在添加有重組人激活素A、重組人成纖維細胞生長因子2和Knockout血清替代物KSR的RPMI-1640培養基中培養1天；

S13、再將S12步驟中得到的細胞在添加有重組人激活素A、重組人成纖維細胞生長因子2和Knockout血清替代物KSR的RPMI-1640培養基中培養1天；

S2、使用BMP抑制劑、重組人成纖維細胞生長因子4、WNT信號激活劑誘導定形內胚層分化為前腸管衍生物；所述BMP抑制劑為Compound C，所述WNT信號激活劑為GSK-3抑制劑CHIR99021；培養天數為4天；

S3、將前腸管衍生物消化為單細胞，先使用前期分化組合物培養6天，再使用后期分化組合物培養3天；其中，前期分化組合物為TGFβ抑制劑、SIRT1抑制劑、重組人血管內皮細胞生長因子、重組人成纖維細胞生長因子2、WNT信號激活劑和重組人上皮生長因子，后期分化組合物為RAR核受體激動劑、SIRT1抑制劑和石膽酸，使前腸管單細胞增殖、分化為勻質且尺寸均一的多譜系肝類器官；所述TGFβ抑制劑為RepSox，所述SIRT1抑制劑為煙酰胺，所述RAR核受體激動劑為全反式維甲酸ATRA，所述WNT信號激活劑為rhWnt3a；

S4、使用MST1/2的抑制劑、α1-腎上腺素能受體激動劑、甲萘醌4、cAMP激活劑、地塞米松MK125和重組人抑瘤素M（rhOSM）組合物實現多譜系肝類器官的藥代成熟化；所述MST1/2的抑制劑為XMU-MP-1，所述α1-腎上腺素能受體激動劑為甲氧胺MX，所述cAMP激活劑為環形AMP類似物8-Br-cAMP；培養天數為8天。

2.根據權利要求1所述的多譜系肝臟類器官的構建方法，其特征在于：步驟S13中KSR的濃度大于步驟S12中KSR的濃度。

3.根據權利要求1所述的多譜系肝臟類器官的構建方法，其特征在于：將步驟S2得到的前腸管衍生物消化為單細胞可作為肝類器官的二級種子細胞，支持凍存與復蘇。

4.一種由權利要求1-3任一項所述的方法構建的多譜系肝臟類器官，其特征在于：所述多譜系肝臟類器官具有以下特征：1）形態勻質、尺寸勻一，大小為150-200μm的球形結構；2）產物包含肝細胞、膽管細胞、肝星狀細胞、肝巨噬細胞；3）高表達關鍵藥物代謝酶CYP3A4與多藥耐藥基因MDR1。

5.一種如權利要求4所述的多譜系肝臟類器官作為高通量藥物篩選的用途。

6.一種用于多譜系肝臟類器官的誘導分化組合物，其特征在于：由以下組分組成：

1）誘導形成定形內胚層組合物：

第一階段：重組人激活素A、重組人骨形態發生蛋白4（rhBMP4）和GSK-3抑制劑CHIR99021；

第二階段：重組人激活素A、重組人成纖維細胞生長因子2和Knockout血清替代物KSR；

第三階段：重組人激活素A、重組人成纖維細胞生長因子2和Knockout血清替代物KSR；

2）誘導分化前腸管衍生物組合物：

BMP抑制劑、重組人成纖維細胞生長因子4、WNT信號激活劑；其中，BMP抑制劑為Compound C，WNT信號激活劑為GSK-3抑制劑CHIR99021；

3）肝臟多譜系特化組合物：

前期分化組合物：TGFβ抑制劑、SIRT1抑制劑、WNT信號激活劑、重組人血管內皮細胞生長因子、重組人成纖維細胞生長因子2和重組人上皮生長因子；其中，TGFβ抑制劑為RepSox，SIRT1抑制劑為煙酰胺，WNT信號激活劑為rhWnt3a；

后期分化組合物：RAR核受體激動劑、SIRT1抑制劑、石膽酸；其中，RAR核受體激動劑為全反式維甲酸ATRA，SIRT1抑制劑為煙酰胺；

4）藥代成熟組合物：

MST1/2的抑制劑、α1-腎上腺素能受體激動劑、甲萘醌4、cAMP激活劑、地塞米松MK125、重組人抑瘤素M（rhOSM）；其中，MST1/2的抑制劑為XMU-MP-1，α1-腎上腺素能受體激動劑為甲氧胺MX，cAMP激活劑為環形AMP類似物8-Br-cAMP。