[發(fā)明專利]一種快速區(qū)分豬圓環(huán)病毒1型、2b型和嵌合型豬圓環(huán)病毒C1-233株的引物及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210119666.3
• 申請(qǐng)日: 2022-02-09
• 公開（公告）號(hào): CN114317833A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高崧;潘昊純;郇長超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 吳波

本發(fā)明提供了一種快速區(qū)分豬圓環(huán)病毒1型、2b型和嵌合型豬圓環(huán)病毒C1?233株的引物及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的引物能夠確保PCR擴(kuò)增的豬圓環(huán)病毒1型毒株基因組不含Ssp I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增的豬圓環(huán)病毒2b型0233株基因組含有兩個(gè)Ssp I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增的嵌合型豬圓環(huán)病毒C1?233株的基因組含有一個(gè)Ssp I酶切位點(diǎn)。進(jìn)而根據(jù)酶切后的瓊脂糖凝膠電泳條帶便能快速、準(zhǔn)確區(qū)分混合樣品中豬圓環(huán)病毒1型、豬圓環(huán)病毒2b型0233株和嵌合型豬圓環(huán)病毒C1?233株，在嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗(C1?233株)研制、生產(chǎn)過程中，為快速、精確區(qū)分疫苗株與其親本株提供了一種簡便方法，克服了普通PCR+基因測序無法區(qū)分混合樣品中疫苗株與親本株的缺陷，具有重要實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速區(qū)分豬圓環(huán)病毒1型、2b型和嵌合型豬圓環(huán)病毒C1-233株的引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒1型(Porcine circovirus 1,PCV1)毒株和豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirus 2,PCV2)毒株屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，其中豬圓環(huán)病毒1型無致病性，豬圓環(huán)病毒2型是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原。嵌合型豬圓環(huán)病毒C1-233株為活疫苗株。豬圓環(huán)病毒1型毒株，基因組大小為1759bp；豬圓環(huán)病毒2b型0233株和嵌合型豬圓環(huán)病毒C1-233株，基因組大小均為1767bp。目前，豬圓環(huán)病毒的檢測方法主要是PCR結(jié)合基因測序方法，但當(dāng)同一樣品中同時(shí)存在PCV1、PCV2兩種毒株時(shí)，應(yīng)用該方法無法區(qū)別，原因是PCV1、PCV2毒株的基因組同源性在70％以上，普通PCR均能擴(kuò)增出來，且其基因組大小相似，無法通過凝膠電泳區(qū)分開；即使將擴(kuò)增產(chǎn)物測序，由于其同源性高，出現(xiàn)重疊峰，亦無法將其區(qū)分開。嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗C1-233株在PCV1基因組骨架上替換其Cap蛋白編碼基因ORF2構(gòu)建而成，其基因組與親本株P(guān)CV1、PCV2的同源性同樣很高，用上述方法依然無法區(qū)分混合樣品中的疫苗株與親本株。建立區(qū)分PCV1、PCV2、PCV1-233株簡便方法的意義在于且不限于：(1)嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗(C1-233株)研制過程中，需要杜絕親本株污染，必須對(duì)疫苗株中可能污染的親本株進(jìn)行甄別；(2)一旦嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗(C1-233株)投入使用，臨床上出現(xiàn)疫苗株、野毒株混合感染的可能性較大，同樣需要區(qū)分疫苗株與野毒株。目前，如需達(dá)到上述目標(biāo)，可行的方法唯有高通量測序。但高通量測序不僅成本高、耗時(shí)長，也無法滿足基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)臨床樣品的檢測需求。因此，發(fā)明一種操作簡便、快速、準(zhǔn)確區(qū)分混合樣品中豬圓環(huán)病毒1型毒株、豬圓環(huán)病毒2b型0233株和嵌合型豬圓環(huán)病毒C1-233株的檢測方法顯得極為重要。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠快速、準(zhǔn)確區(qū)分豬圓環(huán)病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型豬圓環(huán)病毒C1-233株的引物。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種快速區(qū)分豬圓環(huán)病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型豬圓環(huán)病毒C1-233株的引物，所述引物的上游引物為5’-TGT CCCAGC TGTAGAAGC TCT-3’，所述引物的下游引物為5’-GCA GTT GAG GAG TAC CATTCC-3’。

本發(fā)明還提供了一種上述引物在制備快速區(qū)分豬圓環(huán)病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型豬圓環(huán)病毒C1-233株產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種快速區(qū)分豬圓環(huán)病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型豬圓環(huán)病毒C1-233株的方法，所述方法包括如下步驟：采用上述引物對(duì)待測物基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用限制性內(nèi)切酶Ssp I對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，豬圓環(huán)病毒1型毒株為1759bp單一條帶，豬圓環(huán)病毒2b型0233株為659bp、594bp和514bp三條帶，嵌合型豬圓環(huán)病毒C1-233株為1098bp和669bp兩條帶。