[發明專利]一種D-氨基酸氧化酶及其在制備L-草銨膦或其中間體中的應用

在審

• 申請號: 202210114692.7
• 申請日: 2022-01-30
• 公開（公告）號: CN116555206A
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 焦琦;王舒;田振華;程占冰;馬帥;成靜
• 申請（專利權）人: 弈柯萊生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12P9/00;C12P13/04
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 黃益澍

本發明公開了一種D?氨基酸氧化酶及其在制備L?草銨膦或其中間體中的應用。一種D?氨基酸氧化酶，其氨基酸序列與SEQ?ID?NO:1相比包含選自以下一個或多個的氨基酸殘基差異：K29G/H/I/N/Q/W/Y/C/L；V42C/D/E/H/Y；E195N/Y/Q；C234L；V326W；并具有不低于如SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列所示的D?氨基酸氧化酶的活性和/或熱穩定性。本發明提供了一種熱穩定性更高的D?氨基酸氧化酶，在提高酶活性的同時，也擴大了酶的使用溫度范圍，且在較低溫度下使用，能夠延長酶的使用壽命；在較高溫度下使用，可提高酶的催化效率。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種D-氨基酸氧化酶及其在制備L-草銨膦或其中間體中的應用。

背景技術

草銨膦與草甘膦、百草枯并稱世界三大除草劑，都具有非選擇性。其中，由于百草枯極強的毒性，近年來在多個國家嚴被格限制或禁止使用；草甘膦的應用廣泛，但我國A級綠色食品已將其從準用名單中去除。草銨膦具有活性高、除草譜廣、環境相容性好等特點，并且其發揮除草活性的速度優于草甘膦，也可在雜草對草甘膦產生抗性的地區使用，因此具有很大的市場開發潛力和廣闊的應用前景。

2020年，全球草銨膦的市場規模達到10.5億美元，近6年全球市場復合增長率為6.3％，屬于增長最快的非選擇性除草劑。因此開發或優化L-草銨膦生產工藝對于提高經濟效益、降低使用成本、減輕環境壓力具有重要意義。

商業化應用的草銨膦是外消旋體的混合物，有D型和L型兩種異構體，但只有L型具有活性，且在土壤中易分解、毒性小。L-草銨膦的生產主要有兩類方法：化學法和生物法?；瘜W法生產草銨膦主要是Strecker工藝和熱裂解-ACA工藝。其中Srecker工藝流程復雜，涉及原料易燃易爆，且產品的收率較低。熱裂解-ACA工藝復雜，且甲基二氯化磷(MDP)是其前端關鍵中間體，也是該工藝的技術壁壘。生物法反應條件溫和、生產流程簡單，且產物易于分離，但其產量相對較低，成本較高，目前還未實現產業化。

CN105603015A中發明了以2-氧代-4-(羥基(甲基)膦?；?丁酸(PPO)及其鹽為底物，丙氨酸為氨基供體，利用離體的轉氨酶或體外表達轉氨酶的細胞催化底物，與丙氨酸發生轉氨反應，得到L-草銨膦；CN106978453B中發明了一種利用氨基酸脫氫酶制備L-草銨膦的方法，該方法以2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸或其鹽為底物進行轉胺化反應，獲得L-草銨膦。此方法原料轉化率較高，但底物合成工藝復雜，成本較高。

US9834802B2中發明了以D,L-草銨膦為原料，在D-氨基酸氧化酶突變體的催化作用下生成中間產物PPO，PPO在氨基酸轉氨酶的催化作用下生成L-草銨膦。該方法反應得到的組合物含L-草銨膦、D-草銨膦、PPO，其中L-草銨膦含量達到80％以上，D-草銨膦的含量小于10％、PPO含量為小于20％。但是其酶活穩定性仍有待提高。

因此迫切需要尋找一種具有較高的酶活穩定性且D-草銨膦轉化率高，L-草銨膦ee值高的D-氨基酸氧化酶。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是為了克服現有技術中D-氨基酸氧化酶的酶活性不高、酶活穩定性差和L-草銨膦產率低等缺陷。為解決上述技術問題，本發明提供了一種D-氨基酸氧化酶及其在制備L-草銨膦或其中間體中的應用。熱穩定性更高的D-氨基酸氧化酶，在提高酶活性的同時，也擴大了酶的使用溫度范圍，且在較低溫度下使用，能夠延長酶的使用壽命；在較高溫度下使用，可提高酶的催化效率。熱穩定性高的酶具有提高化學反應速率、提高產品質量、活性穩定、耐儲藏等優點。

本發明的第一方面提供一種D-氨基酸氧化酶，其氨基酸序列與SEQ?ID?NO:1相比包含選自以下一個或多個的氨基酸殘基差異：

K29G/H/I/N/Q/W/Y/C/L；V42C/D/E/H/Y；E195N/Y/Q；C234L；V326W；