[發明專利]螢火蟲發光科普教育試劑盒、熒光素酶及其制備方法

在審

• 申請號: 202210106967.2
• 申請日: 2022-01-28
• 公開（公告）號: CN114410598A
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 付新華;朱馨蕾;劉全
• 申請（專利權）人: 武漢霆科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/70;C12N15/53;C12N1/21;G09B23/22;C12R1/19
• 代理公司: 武漢泰山北斗專利代理事務所(特殊普通合伙) 42250
• 代理人: 董佳佳

1.一種熒光素酶，其特征在于，來源于雷氏螢，具有在不同pH條件下發光波長變化的蛋白特性，酸性條件下為橙黃色光，堿性條件下為明黃色光，其氨基酸序列為：SEQ ID NO.1。

2.如權利要求1所述的熒光素酶，其特征在于，其獲取方法為：將雷氏螢luc1基因構建到大腸桿菌表達載體中，獲得重組表達載體，將該重組表達載體轉化大腸桿菌感受態細胞制成重組菌株，利用該重組表達載體在大腸桿菌宿主細胞中表達熒光素酶的蛋白。

3.如權利要求2所述的熒光素酶，其特征在于，重組表達載體和重組菌株合成的具體步驟為：

設計一對引物，以雷氏螢cDNA為模版，進行PCR擴增，將PCR擴增產物回收后，以EcoRI/XhoI進行雙酶切，酶切產物與用同樣酶切的載體pET32a進行連接構建重組表達載體pET32a-luc1，pET32a-luc1轉化大腸桿菌感受態細胞E.coli Rosetta(DE3)，制備重組菌株Rosetta-pET32a-luc1。

4.如權利要求3所述的熒光素酶，其特征在于，引物為：

P1677F：5′-GGAATTCATGGAAAACATGGATAATGATG-3′；

P1677R：5′-CCGCTCGAGCATCTTTGCATTTGGTTTCTTG-3′。

5.權利要求1-4所述熒光素酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、選取Rosetta-pET32a-luc1菌株，按一定比例接入含抗生素的LB培養基，培養獲得種子液；

S2、種子液轉接培養后，加入IPTG誘導培養；

S3、離心收菌，去除上清，瀝干，置于－20℃暫存或直接進行純化；

S4、收集大量表達的菌體，加入適量PBS，20％Triton X-100和PMSF后混勻，用離心管分裝菌液進行超聲破碎，直至菌液澄清半透明狀態；破碎的菌液離心后收集上清；

S5、使用硫酸銨沉淀方法純化蛋白，離心后收集沉淀，溶解沉淀，測定蛋白濃度，并稀釋到工作液所需蛋白終濃度。

6.如權利要求5所述的熒光素酶的制備方法，其特征在于：步驟S1中接種比例為1/100-1/200，步驟S5中硫酸銨純化濃度為35％，蛋白終濃度為1mg/ml。

7.一種螢火蟲發光科普教育試劑盒，該試劑盒的試劑中含有權利要求1-4所述的熒光素酶，其特征在于，包括盒體，盒體右側設有置物孔，上方開設觀察窗，置物孔和觀察窗形成一個觀察倉；盒體內裝有螢火蟲觀察研磨管、研磨棒、反應管、過濾管、巴氏吸管、乳膠手套和試劑，試劑還包括D-luciferin提取緩沖液，發光反應液和變色緩沖液。

8.如權利要求7所述的螢火蟲發光科普教育試劑盒，其特征在于：所述螢火蟲觀察研磨管內含有若干只凍干螢火蟲，凍干螢火蟲收集于飼養基地中已經產卵后死去的完整螢火蟲，并進行凍干處理。

9.如權利要求7所述的螢火蟲發光科普教育試劑盒，其特征在于：D-luciferin提取緩沖液用于提取凍干螢火蟲中的熒光素，為pH6.4的PBS溶液；發光反應液包含ATP、MgCl₂；變色緩沖液為Tris溶液。

10.權利要求7-9任一所述螢火蟲發光科普教育試劑盒的使用方法，其特征在于，包括下列步驟：

S1、帶上乳膠手套，取出試劑盒中試劑；

S2、吸取提取緩沖液，加入到螢火蟲觀察研磨管中，用研磨棒在管中攪動研磨螢火蟲凍干蟲體，至全部研磨破碎；

S3、向反應管內放入過濾管，吸取螢火蟲觀察研磨管中的液體加入到反應管中，液體過濾后丟掉過濾管，蓋上反應管的蓋子，反復搖晃反應管30s，在觀察倉內觀察發光情況；

S4、打開反應管的蓋子，吸取發光反應液，加入到反應管中，蓋上反應管的蓋子，反復搖晃反應管30s，在觀察倉內觀察發光情況；

S5、打開反應管的蓋子，吸取熒光素酶，加入到反應管中，蓋上反應管的蓋子，反復搖晃反應管30s，在觀察倉內觀察發光情況；

S6、打開反應管的蓋子，吸取變色緩沖液，加入到反應管中，蓋上反應管的蓋子，反復搖晃反應管30s，在觀察倉內觀察發光情況；

S7、清理實驗臺面，扔掉垃圾。