[發(fā)明專利]螢火蟲(chóng)發(fā)光科普教育試劑盒、熒光素酶及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210106967.2
• 申請(qǐng)日: 2022-01-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114410598A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付新華;朱馨蕾;劉全
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢霆科生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C12N15/70;C12N15/53;C12N1/21;G09B23/22;C12R1/19
• 代理公司: 武漢泰山北斗專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42250
• 代理人: 董佳佳

本發(fā)明提供了一種熒光素酶，來(lái)源于雷氏螢，具有在不同pH條件下發(fā)光波長(zhǎng)變化的蛋白特性，酸性條件下為橙黃色光，堿性條件下為明黃色光，其氨基酸序列為：SEQ ID NO.1；將熒光素酶應(yīng)用于螢火蟲(chóng)發(fā)光科普教育試劑盒中，可以實(shí)現(xiàn)普通公眾通過(guò)自己操作提取螢火蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)光底物(熒光素)，并進(jìn)行螢火蟲(chóng)發(fā)光的實(shí)驗(yàn)，了解螢火蟲(chóng)發(fā)光的原理。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及螢火蟲(chóng)發(fā)光技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及螢火蟲(chóng)發(fā)光科普教育試劑盒、熒光素酶及其制備方法。

背景技術(shù)

螢火蟲(chóng)因?yàn)槠浒l(fā)光的特性，已經(jīng)成為環(huán)境保護(hù)的指示生物和明星物種，被列入三有保護(hù)名錄，隨著現(xiàn)在螢火蟲(chóng)旅游的熱度逐漸上升，以及螢火蟲(chóng)保護(hù)地增多，公眾逐漸認(rèn)識(shí)到保護(hù)螢火蟲(chóng)的重要性，對(duì)于接觸螢火蟲(chóng)，并進(jìn)行相關(guān)科普教育的需求也越來(lái)越多。但目前主流的科普方式均采用的螢火蟲(chóng)標(biāo)本展示形式，是一種枯燥的形態(tài)展示，缺乏互動(dòng)性和直觀性，無(wú)法更好地展示螢火蟲(chóng)最重要的特征。此外，公眾對(duì)于螢火蟲(chóng)最為好奇的是其發(fā)光，而大家對(duì)于螢火蟲(chóng)的發(fā)光原理知之甚少。

螢火蟲(chóng)有專門(mén)的發(fā)光細(xì)胞，在發(fā)光細(xì)胞中有兩類物質(zhì)，一類被稱作熒光素，另一類被稱為熒光素酶。熒光素作為反應(yīng)底物能在熒光素酶的催化下通過(guò)消耗ATP和氧氣，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，當(dāng)氧化熒光素從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)釋放出光子，從而發(fā)光。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，提供了一種螢火蟲(chóng)發(fā)光科普教育試劑盒、熒光素酶及其制備方法，可以實(shí)現(xiàn)普通公眾通過(guò)自己操作提取螢火蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)光底物(熒光素)，并進(jìn)行螢火蟲(chóng)發(fā)光的實(shí)驗(yàn)，了解螢火蟲(chóng)發(fā)光的原理。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供一種熒光素酶，來(lái)源于雷氏螢，具有在不同pH條件下發(fā)光波長(zhǎng)變化的蛋白特性，酸性條件下為橙黃色光，堿性條件下為明黃色光，其氨基酸序列為：SEQ IDNO.1。

進(jìn)一步地，熒光素酶的獲取方法為：將雷氏螢luc1基因構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體中，獲得重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制成重組菌株，利用該重組表達(dá)載體在大腸桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)熒光素酶的蛋白。

進(jìn)一步地，重組表達(dá)載體和重組菌株合成的具體步驟為：

設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以雷氏螢cDNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，以EcoRI/XhoI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物與用同樣酶切的載體pET32a進(jìn)行連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a-luc1，pET32a-luc1轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3)，制備重組菌株Rosetta-pET32a-luc1。

進(jìn)一步地，引物為：

P1677F：5′-GGAATTCATGGAAAACATGGATAATGATG-3′；

P1677R：5′-CCGCTCGAGCATCTTTGCATTTGGTTTCTTG-3′。

本發(fā)明還提供該熒光素酶的制備方法，包括以下步驟：

S1、選取Rosetta-pET32a-luc1菌株，按一定比例接入含抗生素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得種子液；

S2、種子液轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)；

S3、離心收菌，去除上清，瀝干，置于－20℃暫存或直接進(jìn)行純化；

S4、收集大量表達(dá)的菌體，加入20％Triton X-100和PMSF后混勻，用離心管分裝菌液進(jìn)行超聲破碎，直至菌液澄清半透明狀態(tài)；破碎的菌液離心后收集上清；

S5、沉淀蛋白，離心后收集沉淀，溶解沉淀，測(cè)定蛋白濃度至蛋白終濃度。

進(jìn)一步地，步驟S1中接種比例為1/100-1/200，步驟S5中蛋白終濃度為1mg/ml。