[發明專利]根瘤菌劑的液體劑型制備方法

在審

• 申請號: 202210106149.2
• 申請日: 2022-01-28
• 公開（公告）號: CN114350570A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 楊國平;王明
• 申請（專利權）人: 寧夏五豐農業科技有限公司;五豐生物科技（寧夏）有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/04;C12R1/41
• 代理公司: 深圳華奇信諾專利代理事務所(特殊普通合伙) 44328
• 代理人: 陳子勛

本發明公開了一種根瘤菌劑的液體劑型制備方法，其適合苜蓿根瘤菌、三葉草根瘤菌的菌劑制備，通過將活化的菌種進行高密度發酵，以提高根瘤菌的有效活菌數；最終將發酵后的菌液與PVP保護劑混合后，進行無菌灌裝，保護劑可以穩定活菌數，并且延長活菌的存活時間。

技術領域

本發明涉及微生物制劑技術領域，尤指一種苜蓿根瘤菌、三葉草根瘤菌的菌劑制備方法。

背景技術

苜蓿草根瘤菌劑和三葉草根瘤菌劑一般為干粉劑，播種前將根瘤菌干粉劑與種子混合，將根瘤菌接種到種子表面。苜蓿和三葉草是多年生作物，其根瘤菌劑卻只在播種時以拌種的方式接種一次，隨后的幾年就不能接種根瘤菌了，嚴重影響了苜蓿的固氮效果，生產上迫切需要菌數高的苜蓿和三葉草根瘤菌液體劑型產品。

而液體劑型的根瘤菌劑可以每年隨水澆灌，使根瘤菌能夠到達根部結瘤固氮。但是與其它根瘤菌不同，苜蓿根瘤菌和三葉草根瘤菌在干燥條件下存活時間長，在液體中存活時間短，故要制備液體劑型根瘤菌難度更大。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供一種根瘤菌劑的液體劑型制備方法，提高了菌劑的有效活菌數，在植物的整個生長期間隨時可以反復接種根瘤菌。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是一種根瘤菌劑的液體劑型制備方法，包括以下步驟：

S1、將冷藏的根瘤菌種轉接到YMA培養基斜面上，28℃培養3天，獲得菌苔；

S2、將斜面上的菌苔用無菌水進行清洗，之后再轉接到搖瓶中，28℃培養3 天；

S3、將搖瓶里的根瘤菌液接種到種子發酵罐中，28℃培養3天；

S4、將種子發酵罐里的根瘤菌液轉移到發酵罐中，28℃培養3天；

S5、將PVP保護劑加入發酵罐中與根瘤菌液混合后再進行無菌灌裝，即得到根瘤菌液體劑型。

作為一種優選方案，在步驟S1中，所述根瘤菌種為三葉草根瘤菌或者苜蓿根瘤菌，該根瘤菌種浸泡在30％甘油管中，并保藏于-80℃的冰箱內。

作為一種優選方案，在步驟S1中，所述YMA培養基的配方為：0.8g/L的酵母浸膏；10g/L的甘露醇；0.75g/L的無水磷酸氫二鉀；0.2g/L的七水硫酸鎂； 0.13g/L的二水氯化鈣；15g/L的瓊脂。

作為一種優選方案，在步驟S2中，所述搖瓶為1000mL的搖瓶，其搖床轉速為180rpm。

作為一種優選方案，在步驟S3中，所述種子發酵罐內的攪拌速度為120rpm，通氣量為0.1立方/分鐘，罐壓為0.01MPa，pH在6.5～7.5之間，溶氧為50％～90％。

作為一種優選方案，在步驟S4中，將根瘤菌液轉移到2000L的發酵罐中的培養基上，進行補料分批發酵，最后一次補料后，繼續發酵6小時即可結束發酵；其發酵罐內的攪拌速度為100rpm，通氣量為1.2立方/分鐘，罐壓為0.01MPa， pH在6.5～7.5之間，溶氧為50％～90％。

作為一種優選方案，所述培養基的配方為：0.8g/L的酵母膏、8g/L的甘露醇、0.34g/L的無水磷酸二氫鉀、0.3g/L的七水硫酸鎂、0.15g/L的二水氯化鈣、 1.2g/L的蛋白胨、0.75g/L的硫酸銨、0.78g/L的無水磷酸氫二鉀、0.1g/L的七水硫酸亞鐵。

作為一種優選方案，所述補料分批發酵為：所述培養基的起始體積為1200 升，在28℃培養24小時后開始補料，每6小時添加一次營養液，每次50升，共補料4次。

作為一種優選方案，所述營養液的配方為：20％的甘露醇、2％的酵母膏。

作為一種優選方案，所述PVP保護劑的濃度為10％；所述PVP保護劑與所述根瘤菌液的體積比例為1：100～10：100。