[發明專利]根瘤菌劑的液體劑型制備方法

在審

• 申請號: 202210106149.2
• 申請日: 2022-01-28
• 公開（公告）號: CN114350570A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 楊國平;王明
• 申請（專利權）人: 寧夏五豐農業科技有限公司;五豐生物科技（寧夏）有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/04;C12R1/41
• 代理公司: 深圳華奇信諾專利代理事務所(特殊普通合伙) 44328
• 代理人: 陳子勛

1.一種根瘤菌劑的液體劑型制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、將冷藏的根瘤菌種轉接到YMA培養基斜面上，28℃培養3天，獲得菌苔；

S2、將斜面上的菌苔用無菌水進行清洗，之后再轉接到搖瓶中，28℃培養3天；

S3、將搖瓶里的根瘤菌液接種到種子發酵罐中，28℃培養3天；

S4、將種子發酵罐里的根瘤菌液轉移到發酵罐中，28℃培養3天；

S5、將PVP保護劑加入發酵罐中與根瘤菌液混合后再進行無菌灌裝，即得到根瘤菌液體劑型。

2.根據權利要求1所述的根瘤菌劑的液體劑型制備方法，其特征在于：在步驟S1中，所述根瘤菌種為三葉草根瘤菌或者苜蓿根瘤菌，該根瘤菌種浸泡在30％甘油管中，并保藏于-80℃的冰箱內。

3.根據權利要求1所述的根瘤菌劑的液體劑型制備方法，其特征在于，在步驟S1中，所述YMA培養基的配方為：0.8g/L的酵母浸膏；10g/L的甘露醇；0.75g/L的無水磷酸氫二鉀；0.2g/L的七水硫酸鎂；0.13g/L的二水氯化鈣；15g/L的瓊脂。

4.根據權利要求1所述的根瘤菌劑的液體劑型制備方法，其特征在于：在步驟S2中，所述搖瓶為1000mL的搖瓶，其搖床轉速為180rpm。

5.根據權利要求1所述的根瘤菌劑的液體劑型制備方法，其特征在于：在步驟S3中，所述種子發酵罐內的攪拌速度為120rpm，通氣量為0.1立方/分鐘，罐壓為0.01MPa，pH在6.5～7.5之間，溶氧為50％～90％。

6.根據權利要求1所述的根瘤菌劑的液體劑型制備方法，其特征在于：在步驟S4中，將根瘤菌液轉移到2000L的發酵罐中的培養基上，進行補料分批發酵，最后一次補料后，繼續發酵6小時即可結束發酵；其發酵罐內的攪拌速度為100rpm，通氣量為1.2立方/分鐘，罐壓為0.01MPa，pH在6.5～7.5之間，溶氧為50％～90％。

7.根據權利要求6所述的根瘤菌劑的液體劑型制備方法，其特征在于，所述培養基的配方為：0.8g/L的酵母膏、8g/L的甘露醇、0.34g/L的無水磷酸二氫鉀、0.3g/L的七水硫酸鎂、0.15g/L的二水氯化鈣、1.2g/L的蛋白胨、0.75g/L的硫酸銨、0.78g/L的無水磷酸氫二鉀、0.1g/L的七水硫酸亞鐵。

8.根據權利要求7所述的根瘤菌劑的液體劑型制備方法，其特征在于，所述補料分批發酵為：所述培養基的起始體積為1200升，在28℃培養24小時后開始補料，每6小時添加一次營養液，每次50升，共補料4次。

9.根據權利要求8所述的根瘤菌劑的液體劑型制備方法，其特征在于，所述營養液的配方為：20％的甘露醇、2％的酵母膏。

10.根據權利要求1所述的根瘤菌劑的液體劑型制備方法，其特征在于：所述PVP保護劑的濃度為10％；所述PVP保護劑與所述根瘤菌液的體積比例為1：100～10：100。