[發明專利]一種CRX基因缺失型突變的貓突變體的構建方法及應用

在審

• 申請號: 202210104106.0
• 申請日: 2022-01-28
• 公開（公告）號: CN114517212A
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發明（設計）人: 趙明輝;李惠;由榮靜;王寧
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 武貴

本發明提供一種CRX基因缺失型突變的貓突變體的構建方法，包括：通過敲除貓的野生型CRX基因一個或多個外顯子序列的部分序列，使CRX基因不能正常表達。本發明獲得的CRX基因敲除貓，將為醫學研究提供具有巨大應用價值的疾病動物模型，為推動遺傳性眼部疾病的研究和眼部疾病藥物的篩選奠定基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種CRX基因缺失型突變的貓突變體的構建方法。

背景技術

視網膜退化是由環境、遺傳等多因素導致的視力退行性疾病。視網膜退化病因復雜，其發病與多種因素有關。CRX基因是OTD/OTX同源結構域蛋白家族的成員之一，該家族是哺乳動物眼睛發育所必需的轉錄光受體轉錄因子網絡中的一員，控制光受體基因的表達、發育和維持。在桿狀和錐狀光感受器的發育、成熟和持續生存至關重要。與CRX基因相關的視網膜退化疾病具有顯性遺傳性，這種疾病多發生于兒童時期，導致錐狀細胞營養不良，光感受器細胞退化死亡，早期僅有的現象可能是外觀正常的黃斑或黃斑細小性病變以及視盤蒼白。進展過程中，在黃斑區出現類似骨針狀色素沉積物，視網膜血管衰減，視盤蠟質蒼白，最后出現各種程度的視網膜萎縮。視力開始喪失，最終導致失明，影響了全球大概2百萬的人口。

視網膜退行性疾病為患者和家屬帶來巨大的痛苦和社會負擔。因此，需要建立視網膜退化的動物模型，從而對其病因和治療藥物進行深入研究，雖然嚙齒類動物是最常用的動物模型，但嚙齒類動物視網膜退化形成的病理改變，尤其是后期病變與人體差距較大。

貓是目前基礎醫學和教學中最常用的實驗動物，尤其在生理、藥理和病理學等實驗中起著重要的作用。貓在遺傳性疾病方面與人類也比較相似。且貓的遺傳性疾病少，實驗重復性好，血液循環系統和神經系統尤其發達，生殖和內分泌系統與人類類似。尤其適合藥理、毒理、眼科、外科、產科、皮膚科、心腦血管系統等方面的研究。同時，作為眼科疾病模型，貓有一個光感受器密度更高的中央區域，富含錐狀光感受器，這與人類黃斑有很強的相似性，這也是其他非靈長類實驗動物所不具備的優勢。另外貓體型較小，飼養簡單方便，易于操作，被國際醫學、生物學界公認為比較理想的實驗動物。

目前常用的制備動物疾病模型的主要方法包括：飼喂法、機械損傷及免疫學方法等。它們為測試治療方法的有效性提供了基礎，包括使用藥物和基因替換、新的遺傳方法(siRNA)、干細胞治療、手術干預，如視網膜移植、以及使用眼或視網膜義肢。由于飼喂法、機械損傷和免疫學方法均在健康動物基礎上，采用特殊方法誘導其出現疾病表現。這些誘導模型存在誘導效果不穩定及飼喂誘導周期長，無法遺傳、表型持續時間短，無法真實模擬體內發病機制，尤其是遺傳病發病機制等情況。

利用基因工程方法對非靈長類哺乳動物進行基因改造或轉基因修飾建立疾病動物模型可以克服上述誘導動物模型的缺點。目前，在嚙齒類動物如小鼠、大鼠、兔及家畜如豬、牛、犬等動物上已經陸續有基因編輯動物誕生。而貓屬多次發情動物，發情周期短，生育率高，生理機能等與人類相似，尤其適合進行基因編輯制備人類疾病的動物模型。而貓作為半馴養動物，生殖機理研究不如其他家畜透徹，輔助生殖技術和胚胎工程技術研究不多。造成對貓卵母細胞、受精卵及胚胎體外獲取的難度極大，進而抑制了對貓生殖細胞體外操作的研究發展。致使利用基因敲除、基因修飾和基因插入技術制備疾病模型貓的難度大為增加。因此，即便世界上對貓疾病模型的需求很大，但鮮有成功建立基因敲除或基因修飾疾病模型貓的報道。貓視網膜退化模型更是沒有相關研究。

因此，非常需要建立基于基因編輯和轉基因技術的視網膜退化模型貓，這樣的基因編輯癥狀為原發性癥狀，疾病表型持續時間長，具有可以遺傳的特點，可通過自然繁殖獲得子代疾病模型貓。通過短時間的大量繁殖，為人類眼科視網膜退化的研究和相關治療手段的開發提供合適的基因敲除或者轉基因修飾實驗動物模型。

發明內容