[發明專利]一種CRX基因缺失型突變的貓突變體的構建方法及應用在審
| 申請號： | 202210104106.0 | 申請日： | 2022-01-28 |
| 公開（公告）號： | CN114517212A | 公開（公告）日： | 2022-05-20 |
| 發明（設計）人： | 趙明輝;李惠;由榮靜;王寧 | 申請（專利權）人： | 青島農業大學 |
| 主分類號： | C12N15/89 | 分類號： | C12N15/89;A01K67/027;A61K49/00 |
| 代理公司： | 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531 | 代理人： | 武貴 |
| 地址： | 266109 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 crx 基因 缺失 突變 突變體 構建 方法 應用 | ||
1.一種CRX基因缺失型突變的貓突變體的構建方法，其特征在于，包括：
通過敲除貓的野生型CRX基因一個或多個外顯子序列的部分序列，使CRX基因不能正常表達。
2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，還包括：
1)設計并合成貓CRX基因靶位點的sgRNA序列；
2)將所述sgRNA序列和Cas9蛋白混合，然后共同注射到野生型貓受精卵中，通過鑒定、篩選和培養獲得穩定遺傳的CRX基因缺失型突變的貓突變體；
其中，所述貓CRX基因靶位點的位置為第4外顯子序列(Exon4)。
3.如權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟1)中所述貓CRX基因第4外顯子序列的核苷酸序列為SEQ ID NO:1。
4.如權利要求3所述的構建方法，其特征在于，所述sgRNA序列是通過包括下述步驟的方法制備得到的：
a)確定貓CRX基因第4外顯子的打靶位點序列；
b)針對所述打靶位點序列設計sgRNA序列、sgRNA互補序列、sgRNAPCR擴增引物對；
c)運用sgRNA PCR擴增引物進行PCR擴增并回收獲得T7－sgRNA的PCR產物；
d)利用體外轉錄試劑盒對T7－sgRNA的PCR產物進行體外轉錄，即得sgRNA序列。
5.如權利要求4所述的構建方法，其特征在于，貓CRX基因靶位點的核苷酸序列為SEQID NO:2。
6.如權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述sgRNA序列為SEQ ID NO:3。
7.如權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述sgRNA互補序列為SEQ ID NO:4。
8.如權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述sgRNAPCR擴增引物對由sgRNAPCR擴增引物F和sgRNAPCR擴增引物R組成，其中，所述sgRNAPCR擴增引物F為SEQ ID NO:5,sgRNAPCR擴增引物R為SEQ ID NO:6。
9.如權利要求3所述的構建方法，其特征在于，步驟2)中
篩選貓CRX基因缺失型突變體的引物序列包括正向引物序列SEQ ID NO:7和反向引物序列SEQ ID NO:8。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的構建方法得到的模式生物在篩選用于治療眼部疾病的藥物中的應用。
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