[發(fā)明專利]一種基于適配體的神經(jīng)性貝類毒素比色傳感器及檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210103613.2
• 申請日: 2022-01-24
• 公開（公告）號: CN114460019A
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王平;孔留兵;王心怡;馬馳宇;孫先佑
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78;G01N33/53;G01N33/58
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 劉靜

本發(fā)明公開了一種基于適配體的神經(jīng)性貝類毒素比色傳感器及檢測方法，該傳感器包括如下物質(zhì)：96孔聚苯乙烯微孔板、絡(luò)氨酸修飾的納米金溶液、適配體稀釋液、毒素樣品稀釋液和TMB溶液。取10μL濃度為0.3μM的適配體稀釋液加入到96孔板中，加入20μL不同濃度的毒素樣品稀釋液，反應(yīng)30分鐘。向反應(yīng)后溶液加入100μL絡(luò)氨酸修飾的納米金溶液，反應(yīng)5分鐘。最后加入5μL TMB溶液，反應(yīng)5分鐘。將反應(yīng)好的96孔板放入酶標(biāo)儀中，讀取530nm和610nm處的吸光度，計(jì)算吸光度的比值即A_610nm/A_530nm。本發(fā)明利用適配體對神經(jīng)性貝類毒素特異性檢測，通過TMB誘導(dǎo)納米金聚沉實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)性貝類毒素的定量檢測。本發(fā)明的檢測方法成本低廉，操作便捷，檢測時間短。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種貝類神經(jīng)性毒素檢測分析技術(shù)，尤其涉及一種基于適配體比色傳感器的神經(jīng)性貝類毒素檢測分析方法。

背景技術(shù)

神經(jīng)性貝類毒素(NSP)是一種化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定的脂溶性環(huán)狀聚酯毒素，NSP的主要成份是短裸甲藻毒素(Brevetoxin)，其中Brevetoxin-2是其主要存在形式。NSP中毒癥狀主要分為胃腸道癥狀及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，其中胃腸道中毒癥狀包括惡心、嘔吐、腹瀉、腹絞痛，神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀包括口、唇、舌遠(yuǎn)端感覺異常、口齒不清和頭暈頭痛。NSP中毒嚴(yán)重時會發(fā)展為呼吸窘迫、肢體部分癱瘓。目前國內(nèi)外海產(chǎn)品神經(jīng)性毒素檢測方法主要有小鼠生物法(MBA)，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)和酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)(ELISA)等。MBA方法專業(yè)性較強(qiáng)且個體差異性較大；HPLC-MS雖然具有靈敏度和準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，但其設(shè)備龐大并且價格昂貴；ELISA等酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)同樣存在價格昂貴和檢測成本高等不足，檢測試劑盒也被國外壟斷。適配體是人工合成的單鏈DNA或RNA序列，因?yàn)樗鼈兛梢哉郫B成二級和三級結(jié)構(gòu)，使適配體可以特異性結(jié)合目標(biāo)物質(zhì)。適配體對靶分子有高親和力，其解離常數(shù)范圍從納摩爾到皮摩爾水平。相較于抗體，其穩(wěn)定性更高且可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增，大大節(jié)約成本?；谶m配體比色傳感器的神經(jīng)性貝類毒素檢測分析方法，具有成本低廉、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，便于建立海洋水產(chǎn)品神經(jīng)性毒素的檢測分析平臺，有望成為海洋毒素檢測分析領(lǐng)域的新工具并進(jìn)行推廣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于適配體比色傳感器的貝類神經(jīng)性毒素檢測分析方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一方面，本發(fā)明提供了一種基于適配體的神經(jīng)性貝類毒素比色傳感器，該傳感器包括96孔聚苯乙烯微孔板、絡(luò)氨酸修飾的納米金溶液、適配體BT10稀釋液、神經(jīng)性貝類毒素樣品稀釋液和二甲基聯(lián)苯胺TMB溶液。適配體BT10稀釋液與毒素樣品稀釋液體積比為1:2加入96孔聚苯乙烯微孔板，室溫下混合孵育使兩者結(jié)合；加入絡(luò)氨酸修飾納米金溶液，絡(luò)氨酸修飾納米金溶液與毒素樣品稀釋液體積比為5:1，未與毒素結(jié)合的適配體BT10會與納米金結(jié)合從而保護(hù)納米金免于聚沉；再加入二甲基聯(lián)苯胺TMB溶液，二甲基聯(lián)苯胺TMB溶液與毒素樣品稀釋液體積比為1:4，誘導(dǎo)納米金聚沉，聚沉程度不同導(dǎo)致顏色及吸光度不同，從而構(gòu)建出比色傳感器檢測神經(jīng)性貝類毒素濃度；

所述絡(luò)氨酸修飾的納米金溶液是：稱取質(zhì)量比為6:17的絡(luò)氨酸粉末和氫氧化鉀粉末放入干凈的燒杯中，加入超純水充分?jǐn)嚢枞芙猓患訜釤械娜芤褐练序v狀態(tài)，然后迅速加入2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的氯金酸溶液。繼續(xù)加熱20分鐘后，停止加熱并冷卻至室溫；用透析袋對上述溶液透析過夜，得到絡(luò)氨酸修飾的納米金溶液；絡(luò)氨酸修飾的納米金降低神經(jīng)性貝類毒素在納米金表面的吸附；

所述適配體BT10稀釋液是：將適配體BT10粉末轉(zhuǎn)速4000rpm，離心5分鐘，之后加入pH＝7.0的磷酸鹽緩沖液將適配體BT10稀釋成濃度為50μM的原液；然后進(jìn)行適配體二級結(jié)構(gòu)處理，具體為將裝有上述原液的離心管90℃水浴加熱5分鐘，之后迅速放入4℃環(huán)境中冷卻5分鐘，最后室溫下放置10分鐘，完成二級結(jié)構(gòu)處理；通過使用pH＝7.0的磷酸鹽緩沖液可以將適配體原液稀釋成不同濃度；