[發明專利]一種基于適配體的神經性貝類毒素比色傳感器及檢測方法

在審

• 申請號: 202210103613.2
• 申請日: 2022-01-24
• 公開（公告）號: CN114460019A
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 王平;孔留兵;王心怡;馬馳宇;孫先佑
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78;G01N33/53;G01N33/58
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 劉靜

1.一種基于適配體的神經性貝類毒素比色傳感器，其特征在于，該傳感器包括96孔聚苯乙烯微孔板、絡氨酸修飾的納米金溶液、適配體BT10稀釋液、神經性貝類毒素樣品稀釋液和二甲基聯苯胺TMB溶液。適配體BT10稀釋液與毒素樣品稀釋液體積比為1:2加入96孔聚苯乙烯微孔板，室溫下混合孵育使兩者結合；加入絡氨酸修飾納米金溶液，絡氨酸修飾納米金溶液與毒素樣品稀釋液體積比為5:1，未與毒素結合的適配體BT10會與納米金結合從而保護納米金免于聚沉；再加入二甲基聯苯胺TMB溶液，二甲基聯苯胺TMB溶液與毒素樣品稀釋液體積比為1:4，誘導納米金聚沉，聚沉程度不同導致顏色及吸光度不同，從而構建出比色傳感器檢測神經性貝類毒素濃度；

所述絡氨酸修飾的納米金溶液是：稱取質量比為6:17的絡氨酸粉末和氫氧化鉀粉末放入干凈的燒杯中，加入超純水充分攪拌溶解；加熱燒杯中的溶液至沸騰狀態，然后迅速加入2mL質量分數為1％的氯金酸溶液。繼續加熱20分鐘后，停止加熱并冷卻至室溫；用透析袋對上述溶液透析過夜，得到絡氨酸修飾的納米金溶液；絡氨酸修飾的納米金降低神經性貝類毒素在納米金表面的吸附；

所述適配體BT10稀釋液是：將適配體BT10粉末轉速4000rpm，離心5分鐘，之后加入pH＝7.0的磷酸鹽緩沖液將適配體BT10稀釋成濃度為50μM的原液；然后進行適配體二級結構處理，具體為將裝有上述原液的離心管90℃水浴加熱5分鐘，之后迅速放入4℃環境中冷卻5分鐘，最后室溫下放置10分鐘，完成二級結構處理；通過使用pH＝7.0的磷酸鹽緩沖液可以將適配體原液稀釋成不同濃度；

所述毒素樣品稀釋液是：將神經性貝類毒素Brevetoxin-2溶液用純水稀釋成不同濃度。

2.根據權利要求1所述的一種基于適配體的神經性貝類毒素比色傳感器，其特征在于，適配體BT10的序列為：5’-GGCCACCAAACCACACCGTCGCAACCGCGAGAACCGAAGTAGTGATCATGTCCCTGCGTG-3’。

3.一種基于權利要求1所述比色傳感器的神經性貝類毒素檢測方法，其特征在于，該方法具體步驟為：

(1)取10μL濃度為0.3μM的適配體BT10稀釋液分別加入到96孔聚苯乙烯微孔板中，對應加入20μL不同濃度的毒素樣品稀釋液，反應30分鐘；

(2)向反應后溶液加入100μL絡氨酸修飾的納米金溶液，反應5分鐘；最后加入5μL TMB溶液，反應5分鐘；

(3)將反應好的96孔聚苯乙烯微孔板放入酶標儀中，讀取530nm和610nm處的吸光度，計算吸光度的比值即A_610nm/A_530nm，得到神經性貝類毒素的濃度。