[發(fā)明專利]一種適用于紫薇花芽的石蠟切片方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210103528.6
• 申請(qǐng)日: 2022-01-19
• 公開（公告）號(hào): CN114509290A
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顧翠花;尚林雪;王群;王杰;洪思丹;趙雨;張國(guó)哲;馬清清
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N1/06
• 分類號(hào): G01N1/06;G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種適用于紫薇花芽的石蠟切片方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)固定

將修整后的植物材料，為避免褐化立即放入FAA固定液中，置于4℃冰箱固定24h以上備用。

(2)脫水

脫水處理上按照50％乙醇(30min)→70％乙醇(30min)→70％乙醇(過(guò)夜)→85％乙醇(50min)→95％乙醇(50min)→100％乙醇(50min)→100％乙醇(50min)的梯度進(jìn)行；

(3)透明

采取無(wú)水乙醇∶二甲苯＝3∶1→無(wú)水乙醇∶二甲苯＝1∶1→無(wú)水乙醇∶二甲1∶3→100％二甲苯→100％二甲苯→100％二甲苯(每一級(jí)均處理45min)的梯度進(jìn)行操作；

(4)浸蠟

石蠟∶二甲苯＝1∶3(45℃烘箱過(guò)夜)→石蠟∶二甲苯＝1∶1(53℃烘箱4h)→石蠟∶二甲苯＝3∶1(53℃烘箱4h)→加純蠟(60℃烘箱過(guò)夜)→早晚每隔12h從烘箱中取出換一次純蠟(60℃換蠟3d)進(jìn)行浸蠟處理。

(5)包埋

將浸蠟3d后的植物材料開蓋2h后進(jìn)行包埋，此操作的目的是為了將試管內(nèi)的透明劑(二甲苯)蒸發(fā)干凈。所有的包埋工具(解剖針、鑷子等)以及病理學(xué)包埋盒均從烘箱中取出進(jìn)行包埋操作；

(6)切片

使用實(shí)驗(yàn)室的萊卡Leica RM2335生物切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為9μm；

(7)展片、烤片

用扁頭鑷子輕輕夾住蠟帶放入事先準(zhǔn)備好的含有溫水(18-20℃)的培養(yǎng)皿中讓其展開，待展片完全后將其撈起放置載玻片上，在載玻片上標(biāo)注相關(guān)信息，然后放置烤片機(jī)上，溫度設(shè)置為42℃，烤片時(shí)間12h左右即可。

(8)染色

從烤片機(jī)上取出含有植物材料的載玻片，全部放入染色架上采用1％番紅-0.5％固綠雙重染色法對(duì)植物材料進(jìn)行最終的染色；

(9)封片、觀察

使用中性樹膠封片后，置于室溫晾干后，將載玻片放于顯微鏡室的Axio Imager A2正置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，拍照。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于，步驟(2)脫水操作按照無(wú)水乙醇濃度從低到高逐級(jí)進(jìn)行時(shí)間處理為30min和50min。其中固定后的材料最好放置于70％無(wú)水乙醇中過(guò)夜。

3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述，其特征在于，步驟(3)透明時(shí)間上設(shè)為45min，縮短了材料與各個(gè)階段各個(gè)梯度無(wú)水乙醇接觸的時(shí)間，避免材料過(guò)度失水變形，提高了脫水效率；節(jié)省了整個(gè)石蠟切片實(shí)驗(yàn)的時(shí)間并且縮短了實(shí)驗(yàn)人員與有毒試劑的接觸時(shí)間。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述，其特征在于：步驟(4)(5)(7)設(shè)置了不同的浸蠟時(shí)間和溫度，浸蠟過(guò)程中的石蠟是兩種狀態(tài)的蠟，與二甲苯配比的是液體熱蠟(56-58℃)，且為避免將植物材料“燙黑化”，最好沿試管壁緩慢滴加熱蠟；純蠟指的提前準(zhǔn)備好的固體碎蠟，換入至試管中即可。提前開蓋2h后采用了病理學(xué)包埋盒包埋材料，節(jié)省了修蠟等繁瑣步驟；展片時(shí)使用溫水(18-20℃)，可讓蠟帶在培養(yǎng)皿中舒展開，方便展片。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述，步驟(6)和(8)發(fā)明使用的9μm切片厚度以及1％番紅-0.5％固綠雙重染色法其特征在于：獲得了組織完整、切片干凈、染色清晰、觀察效果最佳的紫薇花芽切片圖。

6.一種適用于紫薇花芽的石蠟切片方法，其特征在于，所述石蠟切片方法由權(quán)利要求1-5中的方法完成。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的紫薇花芽石蠟切片方法在觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織形態(tài)，研究紫薇形態(tài)結(jié)構(gòu)和花芽分化培育新品種等中具有重要意義。