[發(fā)明專利]低內(nèi)毒素膠原蛋白的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210102468.6
• 申請日: 2022-01-27
• 公開（公告）號: CN114452444B
• 公開（公告）日: 2022-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 范代娣;史靜靜;古娟;段志廣;徐茹;嚴(yán)建亞;劉琳
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西巨子生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;A61L27/24;A61L27/50;C07K1/18;C07K1/34;C07K1/36;C07K1/14
• 代理公司: 北京唐頌永信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11755
• 代理人: 劉偉

本發(fā)明涉及一種低內(nèi)毒素膠原蛋白的制備方法，所述低內(nèi)毒素膠原蛋白包括低內(nèi)毒素膠原蛋白液和低內(nèi)毒素膠原蛋白凍干物。所述低內(nèi)毒素膠原蛋白液的制備方法包括上樣、再平衡、洗雜和洗脫步驟。所述低內(nèi)毒素膠原蛋白凍干物的制備方法包括對所述膠原蛋白液進(jìn)行冷凍干燥的步驟。本發(fā)明的低內(nèi)毒素膠原蛋白的膠原蛋白純度為99％以上，且內(nèi)毒素含量低于0.01EU/mg，當(dāng)以4mg/mL的濃度作為膠原蛋白注射液臨床使用時，所述膠原蛋白注射液中的內(nèi)毒素含量低于0.04EU/mL，遠(yuǎn)低于醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY0954?2015規(guī)定的內(nèi)毒素限值0.5EU/mL。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種膠原蛋白，所述膠原蛋白的內(nèi)毒素含量低，通過過濾除菌的無菌加工處理技術(shù)可制備成用于面部填充的膠原蛋白注射液，最大程度保證了用于面部植入劑的安全及有效。

背景技術(shù)

膠原蛋白是一種生物高分子蛋白，是動物結(jié)締組織中的主要成分，也是哺乳動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占蛋白質(zhì)總量的25％～30％。膠原蛋白與組織的形成、成熟、細(xì)胞間信息的傳遞以及關(guān)節(jié)潤滑、傷口愈合、鈣化作用、血液凝固和衰老等有著密切的關(guān)系，是生物科技產(chǎn)業(yè)最關(guān)鍵的原材料之一，在醫(yī)學(xué)材料、化妝品、食品工業(yè)中均有廣泛應(yīng)用。

天然的人膠原蛋白來源受限，目前工業(yè)上使用的天然膠原蛋白主要是通過酸、堿或者酶法提取動物的皮膚或骨骼中的膠原蛋白，其主要來源為動物結(jié)締組織。但從動物組織中提取的膠原蛋白存在動物源疾病等風(fēng)險，同時大規(guī)模的制備對供給側(cè)的動物飼養(yǎng)造成巨大的壓力。

隨著基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，通過采用合適的工程菌株(大腸桿菌、畢赤酵母等)外源性表達(dá)人膠原蛋白，成功地解決了人膠原蛋白大規(guī)模制備的瓶頸問題。但是，利用工程菌株例如畢赤酵母基因工程菌株表達(dá)人膠原蛋白時，人膠原蛋白會在發(fā)酵、純化及保存過程中發(fā)生降解，這增加了生產(chǎn)成本，并且影響了這種方法生產(chǎn)的人膠原蛋白的性能。

推測人膠原蛋白發(fā)生降解的原因可能是其氨基酸序列中含有較多的易發(fā)生水解的位點。因此，技術(shù)人員通過選擇來自天然人膠原蛋白的短氨基酸序列進(jìn)行重復(fù)來構(gòu)建重組膠原蛋白，以期回避易發(fā)生水解的位點，從而提高膠原蛋白的穩(wěn)定性，同時還能保持天然人膠原蛋白的優(yōu)良性能。但是，通過來自天然人膠原蛋白的短氨基酸序列重復(fù)構(gòu)建的重組膠原蛋白，其氨基酸組成及分布都相對單調(diào)，理論上講，這會造成其表面的電荷負(fù)載大，整體不容易達(dá)到穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，因而在水溶液中容易水解、變性，且存在短氨基酸序列重復(fù)單元越短、重復(fù)次數(shù)越多，重組膠原蛋白分子在水溶液中越不穩(wěn)定的傾向。

可以嘗試通過對來自天然膠原蛋白的短氨基酸序列進(jìn)行突變并以此作為重復(fù)單元，從而獲得更耐降解的重組膠原蛋白。但是，這樣通過突變改造得到的重組膠原蛋白與天然人膠原蛋白的同源性降低，可能出現(xiàn)免疫原性問題，因而不適合應(yīng)用于需與人體長期接觸的生物材料。

另一方面，組織工程材料例如皮下填充劑等是膠原蛋白的一個重要應(yīng)用方向，作為組織工程材料，要求膠原蛋白具有良好的力學(xué)強度和在水溶液中的穩(wěn)定性(可在水溶液中長期保存)。一般而言，膠原蛋白的分子量越大，其力學(xué)強度就越好，而其在水溶液中的穩(wěn)定性越差，對于通過來自天然人膠原蛋白的短氨基酸序列重復(fù)構(gòu)建的重組膠原蛋白而言更是如此。

天然人膠原蛋白的單鏈分子量約為110-130kD，從實用性的觀點出發(fā)，技術(shù)人員普遍認(rèn)為適合替代天然人膠原蛋白用作組織工程材料的膠原蛋白的分子量需要達(dá)到100kD以上。然而，正如前述，天然的人膠原蛋白來源受限，動物源膠原蛋白存在傳播疾病的風(fēng)險，基因工程表達(dá)的人膠原蛋白容易在發(fā)酵、純化及保存過程中發(fā)生降解，通過來自天然人膠原蛋白的短氨基酸序列重復(fù)構(gòu)建的重組膠原蛋白在水溶液中不穩(wěn)定，而通過突變改造得到的重組膠原蛋白又存在免疫原性問題，因此，如何獲得適合替代天然人膠原蛋白用作組織工程材料的膠原蛋白成為本技術(shù)領(lǐng)域的限制性問題。