[發(fā)明專利]低內(nèi)毒素膠原蛋白的制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202210102468.6 | 申請日： | 2022-01-27 |
| 公開（公告）號： | CN114452444B | 公開（公告）日： | 2022-10-21 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 范代娣;史靜靜;古娟;段志廣;徐茹;嚴(yán)建亞;劉琳 | 申請（專利權(quán)）人： | 陜西巨子生物技術(shù)有限公司 |
| 主分類號： | C07K14/78 | 分類號： | C07K14/78;A61L27/24;A61L27/50;C07K1/18;C07K1/34;C07K1/36;C07K1/14 |
| 代理公司： | 北京唐頌永信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11755 | 代理人： | 劉偉 |
| 地址： | 710077 陜西省西安市*** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 內(nèi)毒素 膠原 蛋白 制備 方法 | ||
1.一種低內(nèi)毒素膠原蛋白液的制備方法，其包括下述步驟：
步驟A：將膠原蛋白樣本液上樣于陽離子交換層析柱，所述膠原蛋白樣本液是包含膠原蛋白、1～3v/v％的PEG-8辛酸/癸酸甘油酯類和2～5v/v％的吐溫80、0.1644w/v％的磷酸二氫鈉、0.0894w/v％的磷酸氫二鈉和0.585w/v％的氯化鈉的水溶液，pH為6.5；
步驟B：依次用緩沖液1～3分別進(jìn)行陽離子交換層析柱再平衡、洗雜、洗脫，收集洗脫峰于去內(nèi)毒素的收集管中，得到低內(nèi)毒素膠原蛋白液，
所述緩沖液1作用為陽離子交換層析柱的再平衡，其為包含1～3v/v％的PEG-8辛酸/癸酸甘油酯類、2～5v/v％的吐溫80、0.1644w/v％的磷酸二氫鈉、0.0894w/v％的磷酸氫二鈉和0.585w/v％的氯化鈉的水溶液，pH為6.5，體積是所述膠原蛋白樣本液的體積的0.5～2倍；
所述緩沖液2作用為洗雜，其為包含0.1644w/v％的磷酸二氫鈉、0.0894w/v％的磷酸氫二鈉和1.17w/v％的氯化鈉的水溶液，pH為6.5，體積是所述膠原蛋白樣本液的體積的1～3倍；
所述緩沖液3作用為洗脫，其為包含0.1644w/v％的磷酸二氫鈉、0.0894w/v％的磷酸氫二鈉和5.85w/v％的氯化鈉的水溶液，pH為6.5，體積是所述膠原蛋白樣本液的體積的0.3～1倍；
所述膠原蛋白是大分子I型重組膠原蛋白，所述大分子I型重組膠原蛋白，其由來自天然人I型膠原蛋白的短氨基酸序列作為重復(fù)單元進(jìn)行多次重復(fù)而構(gòu)成，其中，所述短氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重復(fù)次數(shù)為75～110次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低內(nèi)毒素膠原蛋白液的制備方法，其中，所述步驟A之前還進(jìn)行下述步驟：用基礎(chǔ)溶液平衡陽離子交換層析柱，直到基線穩(wěn)定不變；
所述基礎(chǔ)溶液為包含0.1644w/v％的磷酸二氫鈉、0.0894w/v％的磷酸氫二鈉和0.585w/v％的氯化鈉的緩沖液，pH 6.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低內(nèi)毒素膠原蛋白液的制備方法，其中，所述陽離子交換層析柱為Capto S陽離子交換層析柱，使用前采用0.5M NaOH處理30min以去除熱原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低內(nèi)毒素膠原蛋白液的制備方法，其中，所述步驟A中，所述膠原蛋白樣本液的量為10L以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低內(nèi)毒素膠原蛋白液的制備方法，其中，所述步驟B中，將經(jīng)檢測確認(rèn)膠原蛋白純度為99％以上的收集于去內(nèi)毒素的收集管中的洗脫峰進(jìn)行超濾濃縮，得到超濾濃縮液，將該超濾濃縮液作為低內(nèi)毒素膠原蛋白液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低內(nèi)毒素膠原蛋白液的制備方法，其中，所述短氨基酸序列的重復(fù)次數(shù)為80～105次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低內(nèi)毒素膠原蛋白液的制備方法，其中，所述短氨基酸序列的重復(fù)次數(shù)為82～102次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低內(nèi)毒素膠原蛋白液的制備方法，其中，
所述緩沖液1的體積是所述膠原蛋白樣本液的體積的1倍；
所述緩沖液2的體積是所述膠原蛋白樣本液的體積的1.5倍；
所述緩沖液3的體積是所述膠原蛋白樣本液的體積的0.5倍。
9.一種低內(nèi)毒素膠原蛋白凍干物的制備方法，其包括：采用權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的低內(nèi)毒素膠原蛋白液的制備方法制備低內(nèi)毒素膠原蛋白液，并將所述低內(nèi)毒素膠原蛋白液冷凍干燥，從而得到低內(nèi)毒素膠原蛋白凍干物。
10.一種低內(nèi)毒素膠原蛋白液或低內(nèi)毒素膠原蛋白凍干物，其中，膠原蛋白的純度為99％以上，且內(nèi)毒素含量低于0.01EU/mg；
其中，所述膠原蛋白是大分子I型重組膠原蛋白，所述大分子I型重組膠原蛋白，其由來自天然人I型膠原蛋白的短氨基酸序列作為重復(fù)單元進(jìn)行多次重復(fù)而構(gòu)成，其中，所述短氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重復(fù)次數(shù)為75～110次。
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