[發明專利]一種超靈敏DNA-生物大分子傳感器、構建及其應用

在審

• 申請號: 202210100203.2
• 申請日: 2022-01-27
• 公開（公告）號: CN114487066A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 劉培峰;李鳳琴;顧臻
• 申請（專利權）人: 上海市腫瘤研究所;浙江大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327
• 代理公司: 上海恒慧知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 31317
• 代理人: 鄔震中

本發明提供一種超靈敏DNA?生物大分子傳感器，構建及其應用。系由溶液相、界面相以及經輔助探針自組裝的金電極組成，溶液相由適配體/信號探針雙鏈組成，界面相為上述的金電極和溶液相之間的界面。本發明還提供了上述傳感器在癌癥樣本中的檢測應用，能有效的檢測乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌血漿樣本中的促黃體生成激素。本發明傳感器制備簡便，成本低廉，可重復使用。

技術領域

本發明屬于生物技術和檢測技術領域，具體涉及一種超靈敏DNA-生物大分子傳感器、構建及其在臨床腫瘤樣本中的檢測應用。

背景技術

生物大分子(如激素和蛋白質)的體外診斷檢測，對疾病和癌癥的早期預警起著至關重要的作用。目前生物大分子檢測的主流方法是免疫印跡法(western blots,WB)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，它們具有較高的靈敏度和選擇性，但也存在儀器和試劑昂貴、多步驟、再生困難等問題。隨著對衛生概念的日益重視，迫切需要開發成本低廉、操作簡單和靈敏度高的檢測平臺，以便滿足頻繁和即時的診斷應用。

近年來，隨著配體指數富集系統進化(SELEX)技術的不斷發展，基于核酸適配體的電化學(E-AB)傳感器有望成為低成本、簡單、靈敏的即時診斷系統。例如，Kevin W.Plaxco及其同事開發了一種E-AB傳感器，可直接檢測血清中血小板衍生生長因子，檢測限為50pM。此外，他們還證明了E-AB傳感器可以連續、實時地測量活體動物的藥代動力學。最近，Tanner等通過SELEX技術獲得了一個高親和力的促黃體生成素激素(LH)的適配體，并建立了一個E-AB機器人用于LH的連續監測。E-AB傳感器記錄適配體特異性結合分子靶標前后構象變化所產生的電化學信號。雖然E-AB傳感器能夠檢測各種目標，包括金屬離子、藥物分子和蛋白質，但由于其有限的表面積和較大的空間位阻，對生物大分子(5nm)的檢測靈敏度仍處于納摩爾水平。因此，降低靶標生物大分子在界面上引起的空間位阻以實現靈敏檢測一直是研究的重點與難點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種超靈敏DNA-生物大分子傳感器，構建及其在臨床腫瘤樣本檢測中的應用。解決現有基于界面的檢測方法中生物大分子具有較大空間位阻的問題。

本發明構建兩相轉移的超靈敏DNA-生物大分子傳感器，通過將大分子的捕獲反應轉移到溶液相中，取代下來單鏈信號探針(～1nm)與界面靠近，大大降低界面的空間位阻，從而提高檢測的靈敏度。該傳感器具有很好的臨床診斷應用前景。

本發明的超靈敏DNA-生物大分子傳感器由溶液相、界面相和自組裝的金電極組成；其中，溶液相是含有適配體/信號探針(aptamer/signal)雙鏈的反應溶液；自組裝的金電極是經輔助探針(helper)自組裝的金電極；界面相是溶液相與上述電極之間的界面。所述的靶標生物大分子為激素、蛋白等。

所述的溶液相是加入aptamer/signal雙鏈的反應溶液。所述的aptamer和signal的摩爾濃度比為1:1～1:4，如1:4，1:2，3:4，1:1，3:2，2:1。其中，所述的靶標可以為促黃體生成激素、前列腺特異性抗原等。所述aptamer/signal雙鏈濃度為10nM～50nM。

所述的signal探針為標記了電化學指示劑的DNA鏈。所述的氧化還原指示劑為亞甲基藍(MB)或二茂鐵(Fc)。所述的界面相是經過輔助探針自組裝的金電極與上述溶液相之間的界面。所述金電極直徑為0.5～5mm。

所述aptamer和signal雜交緩沖溶液為TM緩沖溶液(50mM MgCl₂，20mM Tris，pH8.0)。

所述輔助探針(helper probe,HP)組裝濃度為0.1μM～1.5μM。所述PBS緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.4)，包含NaCl濃度為0.1M～1.5M。