[發明專利]一種iPSC技術誘導分化的多巴胺能神經元中單囊泡儲存的分析方法

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• 申請號: 202210098870.1
• 申請日: 2022-01-24
• 公開（公告）號: CN114441413A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 朱婉瑩;劉妍;陶夢丹;徐敏
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: G01N15/10
• 分類號: G01N15/10;G01N27/327;G01N27/416;G01N33/50;C12N5/0793
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本發明公開了一種iPSC技術誘導分化的多巴胺能神經元中單囊泡儲存的分析方法。該方法依次包含Nano?tip微電極的制備、人多能干細胞的復蘇與培養、多巴胺能神經元的定向分化和單囊泡檢測。本發明中將基于Nano?tip微電極的單細胞分析技術與iPSC技術誘導的人源性帕金森病疾病模型相結合，構建了單個神經元中單囊泡分析的方法，為帕金森疾病的病理學研究提供一種新的化學視角，為PD和其他神經退行性疾病的新藥發現提供了新的平臺和途徑。

技術領域

本發明屬于分析檢測技術領域，具體涉及一種iPSC技術誘導分化的多巴胺能神經元中單囊泡儲存的分析方法。

背景技術

神經系統是人體內起主導作用的功能調節系統，是產生認知、學習、記憶、情緒、心理活動及控制運動的重要物質基礎。神經元是構成神經系統的基本單位，神經元細胞間的信號傳遞是通過突觸囊泡中的神經遞質(如多巴胺，乙酰膽堿，谷氨酸，多肽類等)完成的。單個囊泡中神經遞質的含量對于信號傳導有著重要的影響，與多種神經疾病的發生發展有關。但由于囊泡極其微小(納米級)，目前仍缺乏高靈敏度高時空分辨率的神經遞質分析方法，對于這一過程的調控機制了解甚少。因此，單細胞水平內對囊泡儲存情況進行檢測，是近些年來神經科學領域面臨的一個非常重大的問題。

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見的嚴重危害人類健康的神經退行性疾病，其最主要的病理改變是中腦黑質多巴胺(dopamine,DA)能神經元的變性死亡，由此而引起紋狀體多巴胺含量顯著性減少。目前，導致這一病理改變的原因是否與單囊泡中神經遞質儲存有關有待確證。因此，建立高靈敏度的神經遞質分析方法，對神經元內單囊泡儲存情況，從單細胞水平揭示神經元囊泡儲存情況與帕金森病發病直接的關系具有重要意義。

單細胞的分析可以從單細胞水平上反映細胞活動的規律，能夠更深層次地從分子水平反映生物分子在活細胞中的功能和作用，揭示重要的生物過程和信號傳導機制的本質和規律，為探究疾病早期的起因、發展和治療提供更可靠的科學依據。單細胞的分析技術由于發揮關鍵作用的生物分子含量極低而面臨著巨大的挑戰。電化學技術因具有靈敏度高、可實現實時監測等優點而被應用于生物系統中單細胞生物過程中重要生物分子的實時定量分析，其中微電極相對于宏觀尺寸電極具有更小的尺寸、更強的電流密度，更高的信噪比，更快的傳質速度等，非常適合從單細胞水平對生物過程進行快速靈敏地監測。基于微電極的檢測方法為神經元之間信號傳遞規律的研究提供有力的技術支持。

人類誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)是近些年來發展最迅速的領域，2012年山中伸彌獲得諾貝爾獎之后，iPSCs被公認為最重要的科技之一，并受到廣泛的關注。以病人體細胞重新編程而來的iPSCs在特定條件下，可定向分化為病人身體任意一種細胞。其最大優勢在于它取材于人類體細胞，從而建立病人特異性iPSC從而構建疾病的模型。病人iPSC來源的特定譜系細胞已經廣泛用于構建疾病模型、藥物篩選等研究。hiPSCs直接誘導定向分化為特種神經元技術的出現，為建立應用分化得到多巴胺能神經元的帕金森病病模型提供了可能。

綜上所述，本發明擬基于nano-tip微電極建立一種監測iPSC技術誘導分化的多巴胺能神經元中單囊泡儲存情況的測定方法。同時分析正常組，帕金森病模型組和藥物干預組的多巴胺能神經元囊泡儲存情況的變化，揭示帕金森病可能的發病機理同時篩選潛在的治療藥物。本發明不僅為單細胞水平的單囊泡儲存情況提供新思路、新方法，而且對神經科學領域疾病的發病機制研究及藥物篩選等研究具有重要理論意義和廣泛實用價值。

發明內容