[發明專利]一種iPSC技術誘導分化的多巴胺能神經元中單囊泡儲存的分析方法

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• 申請號: 202210098870.1
• 申請日: 2022-01-24
• 公開（公告）號: CN114441413A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 朱婉瑩;劉妍;陶夢丹;徐敏
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: G01N15/10
• 分類號: G01N15/10;G01N27/327;G01N27/416;G01N33/50;C12N5/0793
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 高爽

1.一種iPSC技術誘導分化的多巴胺能神經元中單囊泡儲存的分析方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

a)Nano-tip微電極的制備：將碳纖維吸入硼硅玻璃毛細管中，通過拉針儀，玻璃受熱熔斷后，變成長短相同的兩部分，碳纖維暴露，在顯微鏡下將暴露的碳纖維切至100-150μm，將碳纖維置于丁烷噴槍的火焰邊緣蝕刻在3秒以下，碳纖維的tip端出現紅點，將電極從火焰離開，電極中的碳纖維形成尖頭，將電極放入環氧樹脂膠中1-3min，封閉玻璃管與碳纖維之間的空隙，接著浸入丙酮中洗去碳纖維上的膠，隨后，放入100℃的烘箱中，過夜，制備完成的電極放入含0.10mM多巴胺的pH 7.4的PBS溶液中，測定其循環伏安行為，出現近似S型循環伏安曲線，且電流平臺在1.5-3nA的電極即為達到要求的電極；

b)人多能干細胞的復蘇與培養：快速將凍于液氮罐內的細胞取出解凍得到細胞懸液，將細胞懸液加入5ml DMEM/F12培養基中，高速離心后棄去上清，E8培養基重懸細胞后轉移至Vitronectin包被的培養皿內，使用無異源性培養基Essential 8維持其生長，每日換液，直至人多能性干細胞呈現核質比高，形狀規則的狀態；

c)多巴胺能神經元的定向分化：首先將適量人多能干細胞接種于鋪有Matrigel的六孔板內，并在含有2μM SB、2μMMH1、0.4μM CHIR、20-500ng/mL SHH的NIM培養基中貼壁培養，隔天換液，第九天時，將人多能干細胞吹下，并離心處理，離心結束后，棄上清，用含有CHIR、SHH、0.5-2μM SAG的NIM培養液將沉淀重懸，最后轉移至培養瓶中進行懸浮培養，隔天換液，第13天將培養液替換為含有SAG以及80-120ng/mL FGF8b的NIM培養基，第19天時，將培養液替換為含有SHH以及FGF8b的NIM培養基，第34天時，接種至Matrigel包被的小圓玻片上，用含有10ng/mL BDNF、10ng/mL GDNF、5-15ng/mLTGF-β3、1μM cAMP、1μM Compound E的NIM培養基繼續培養至第45天；

d)單囊泡檢測：單囊泡檢測是在倒置顯微鏡下完成的，整個測定過程在法拉第籠里進行，測定時的工作電極為步驟a)制備的Nano-tip微電極，參比電極為Ag/AgCl電極；用微操作器將Nano-tip微電極插入步驟c)得到的多巴胺能神經元，插入同時采用膜片鉗放大器以恒電位法記錄電流，測定電位為+700-800mV，輸出信號采用Axon過濾器在0.3kHz下過濾信號，輸出信號通過數字化儀以5kHz數字化；記錄的電化學數據使用Igor Pro 6.22程序進行數據處理；電流的過濾器為1kHz；電流峰大于噪音三倍的峰被保留，不滿足條件的峰去除；每個神經元測定后得到多個峰，每個峰表明一個囊泡儲存情況；根據單個峰，可以得到如下參數：(1)I_max(2)t_half(3)Q，分子量，曲線下面積值。

2.根據權利要求1所述的單囊泡儲存的分析方法，其特征在于步驟“a)”中，將碳纖維放置在丁烷噴槍的火焰邊緣蝕刻1-3秒。

3.根據權利要求1所述的單囊泡儲存的分析方法，其特征在于步驟“a)”中，電極在環氧樹脂膠中的時間為2min。

4.根據權利要求1所述的單囊泡儲存的分析方法，步驟“c)”中的前八天培養基中含有的SHH的濃度為250-300ng/mL。

5.根據權利要求1所述的單囊泡儲存的分析方法，其特征在于步驟“c)”中第34天后培養基中含有的TGF-β3的濃度為10ng/mL。

6.根據權利要求1所述的單囊泡儲存的分析方法，其特征在于步驟“d)”中以恒電位法記錄電流，測定電位為+700-780mV。