[發明專利]一種檢測miRNA的CDA探針引物組、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202210098619.5
• 申請日: 2022-01-27
• 公開（公告）號: CN114410754A
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 毛瑞;蔡挺
• 申請（專利權）人: 國科寧波生命與健康產業研究院;中國科學院大學寧波華美醫院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 上海碩力知識產權代理事務所(普通合伙) 31251
• 代理人: 王法男

本發明公開了一種檢測miRNA的CDA探針引物組、試劑盒及其應用。所述CDA探針引物組包括：探針1、探針2、引物MF、引物MR；探針1從3’到5’端分別由R1c區和T1區組成，探針2從3’到5’端分別由T2區、M區和F1區組成，引物MF由F1區和M1c區組成，引物MR由R1區和M2區組成；其中T1區與待測miRNA的部分序列互補，T2區與待測miRNA的另一部分序列互補，T1和T2兩部分與完整的待測miRNA序列互補；所述M區包括M1區和M2區，M1區與M1c區互補，M2區與M2c區互補，R1區與R1c區互補，F1區與F1c區互補；所述探針1的5’端被磷酸化修飾。本發明提供的方法或試劑盒無需昂貴的儀器、也無需復雜的操作即可完成對miRNA的快速準確檢測。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測miRNA的CDA探針引物組、試劑盒及其應用。

背景技術

微小核糖核酸(microRNAs或miRNAs)是一類內生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA，其在細胞內具有多種重要的調節作用。其復雜的調節網絡系統表現在既可以通過一個microRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個microRNAs的組合來精細調控某個基因的表達。學術研究已經證明，人類已知癌癥的發生發展與microRNA的表達失調有著直接聯系。

最常用的microRNA檢測方法是NorthernBlot，也被認為是microRNA檢測和確認的金標準。該方法是經典的探針雜交檢測法，特異性和靈敏度不高。現有基于RT-PCR的microRNA商業檢測試劑盒主要為基于polyA加尾和頸環結構介導等的信號轉換技術，這些試劑盒在目前的應用中操作繁瑣、通量較低。

現在，對microRNA檢測新技術的研究主要基于恒溫擴增、核酸酶、納米技術、量子點的等信號放大方法。其中，環介導恒溫擴增(LAMP)反應作為特異性和靈敏度均非常高的恒溫擴增反應，研究者亦探索了其在microRNA檢測方面的應用。基于閉合頸環介導的核酸恒溫擴增技術(Closed Dumbbell mediated Isothermal Amplification of nucleicacids，CDA)是由中國科學院大學寧波生命與健康產業研究院開發的新方法，可替代日本LAMP核酸擴增方法(中國專利申請號：202110473121.8)。該方法主要利用2種不同的特異性引物識別靶基因的特定區域，在等溫條件進行擴增反應。與常規基因檢測手段(如PCR等)相比，CDA反應在恒溫水浴箱內便可完成，對儀器設備的要求較低，且操作簡單，非專業人士也可準確地完成，適合于基層醫療機構及地方檢驗檢疫部門。

發明內容

本發明的目的是，提供一種檢測miRNA的CDA探針引物組、試劑盒及其應用。旨在解決現有技術中miRNA檢測操作復雜，靈敏度不高的技術問題。

本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案如下：

一種非疾病診斷目的的檢測miRNA的CDA探針引物組，該探針引物組包括：探針1、探針2、引物MF、引物MR；探針1從3’到5’端分別由R1c區和T1區組成，探針2從3’到5’端分別由T2區、M區和F1區組成，引物MF由F1區和M1c區組成，引物MR由R1區和M2區組成；其中T1區與待測miRNA的部分序列互補，T2區與待測miRNA的另一部分序列互補，T1和T2兩部分與完整的待測miRNA序列互補；所述M區包括M1區和M2區，M1區與M1c區互補，M2區與M2c區互補，R1區與R1c區互補，F1區與F1c區互補；所述探針1的5’端被磷酸化修飾。所述F1區、M區、R1區其具體序列可為設計的任意序列，各區長度約為20bp左右。

參見圖1，為探針1和探針2通過miRNA合成CDA反應模板的示意圖。

本發明還提供一種檢測miRNA的試劑盒，該試劑盒包括所述的CDA探針引物組。