[發明專利]一種檢測miRNA的CDA探針引物組、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202210098619.5
• 申請日: 2022-01-27
• 公開（公告）號: CN114410754A
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 毛瑞;蔡挺
• 申請（專利權）人: 國科寧波生命與健康產業研究院;中國科學院大學寧波華美醫院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 上海碩力知識產權代理事務所(普通合伙) 31251
• 代理人: 王法男

1.一種非疾病診斷目的的檢測miRNA的CDA探針引物組，該探針引物組包括：探針1、探針2、引物MF、引物MR；探針1從3’到5’端分別由R1c區和T1區組成，探針2從3’到5’端分別由T2區、M區和F1區組成，引物MF由F1區和M1c區組成，引物MR由R1區和M2區組成；其中T1區與待測miRNA的部分序列互補，T2區與待測miRNA的另一部分序列互補，T1和T2兩部分與完整的待測miRNA序列互補；所述M區包括M1區和M2區，M1區與M1c區互補，M2區與M2c區互補，R1區與R1c區互補，F1區與F1c區互補；所述探針1的5’端被磷酸化修飾。

2.一種檢測miRNA的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括權利要求1所述的CDA探針引物組。

3.如權利要求2所述的檢測miRNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括核酸鏈連接反應液和CDA擴增反應液，其中核酸鏈連接反應液包括核酸鏈連接酶、反應緩沖液、探針1、探針2；所述CDA擴增反應液包括引物MF和引物MR、Bst聚合酶、CDA反應緩沖液、超純水。

4.如權利要求3所述的檢測miRNA的試劑盒，其特征在于，所述核酸鏈連接反應液的組成為：

3-7U T4 RNA連接酶2

1X T4 RNA連接酶2反應緩沖液

100-2000nM探針1

100-2000nM探針2。

5.如權利要求3所述的檢測miRNA的試劑盒，其特征在于：所述CDA反應緩沖液包括Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄和Triton X-100。

6.如權利要求3所述的檢測miRNA的試劑盒，其特征在于：所述CDA擴增反應液還包括顯色劑，所述顯色劑選自SYBR green I、Eva green、羥基萘酚藍、鉻黑T中的一種。

7.如權利要求3所述的檢測miRNA的試劑盒，其特征在于，所述CDA擴增反應液的組成為：

2-50mM Tris-HCl pH8.8

2-20mM KCl

2-20mM(NH₄)₂SO₄

2～20mM MgSO₄

0.1～0.5％TritonX-100

0.2～1M甜菜堿

1～1.6mM dNTP

5～10U Bst DNA聚合酶

100～150μmol/L顯色劑

1～2μM引物MF

1～2μM引物MR；

反應溶劑為超純水。

8.權利要求3所述試劑盒非疾病診斷目的的檢測miRNA的方法，包括以下步驟：

步驟1，將核酸鏈連接酶和反應緩沖液、探針1、探針2混合，制得核酸鏈連接反應液；制得的核酸鏈連接反應液于35-38℃反應50-70min。

步驟2，將步驟1反應完畢的核酸鏈連接反應液與CDA擴增反應液混合，于60～65℃反應20～80min，根據擴增結果判斷樣品中是否含有miRNA。

9.權利要求1所述的CDA探針引物組在非疾病診斷目的的miRNA檢測中的應用。

10.權利要求2-7任一項所述的試劑盒在非疾病診斷目的的miRNA檢測中的應用。