[發明專利]一種基于比色法快速檢測柑橘黃龍病的試劑盒和方法

在審

• 申請號: 202210097151.8
• 申請日: 2022-01-26
• 公開（公告）號: CN114441520A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 鄧方坤;蔡德珍;危云云;歐陽智剛;王希;盧占軍;胡珊玲;劉新軍;徐梅;占軍平
• 申請（專利權）人: 江西新龍生物科技股份有限公司;江西省科學院應用化學研究所
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/01;G01N1/28
• 代理公司: 北京天盾知識產權代理有限公司 11421
• 代理人: 張彩珍

本發明公開了一種基于比色法快速檢測柑橘黃龍病的試劑盒，包括溶解液、淀粉顯色液、比色卡和檢測試紙；其中，檢測試紙為砂紙，比色卡包括不同淀粉濃度對應的顯色照片；該試劑盒操作簡單且操作所需時間短，滴入碘液后即時檢測出結果，利于田間的即時取樣檢測，具有快速高效簡便的特點，而且比色的界限清晰，判定準確，顯著提高檢測準確率；本發明公開了一種基于比色法快速檢測柑橘黃龍病的方法，該方法簡單、易操作且檢測準確率高。

技術領域

本發明涉及柑橘黃龍病檢測技術領域，具體涉及一種基于比色法快速檢測柑橘黃龍病的試劑盒和方法。

背景技術

在我國柑橘黃龍病主要是由柑橘韌皮桿菌的亞洲種(CandidatusLiberibacterasiaticus)所導致，黃龍病的傳播包括嫁接、柑橘木虱傳播以及帶病(蟲)柑橘苗木的私調亂引增多，黃龍病的傳播導致該病有逐年擴大的趨勢；目前黃龍病仍然沒有治愈的辦法，該病極易傳播，而且樹體感染病菌后在5年到10年死亡，造成柑橘絕產；目前只能通過砍樹、控制木虱和改種其他品種果樹來緩解黃龍病的擴散，但是這些措施仍然無法有效遏制黃龍病的蔓延；據統計中國柑橘總量占世界柑橘總量的12％，然而黃龍病發生對我國的柑橘產業特造成了巨大的威脅；柑橘從種植到豐產要七八年左右，而黃龍病的發生毀掉了果農近十年的心血，給農戶造成了巨大的經濟損失，對于我國整個柑橘產業而言，黃龍病始終是無法繞開的核心課題。

黃龍病的快速檢測特別是在能為廣大農戶廣泛使用的便捷快速檢測方法是整個黃龍病防控的關鍵一環，目前柑橘黃龍病的檢測方法包括使用熒光定量PCR方法進行檢測、基于單克隆抗體技術進行檢測、采用目測的方法來觀察黃龍病的有無以及基于碘淀粉反應的診斷方法進行檢測。

使用熒光定量PCR方法進行檢測例如通過改進引物或者PCR方法進行黃龍病的檢測，該方法需要從柑橘葉片葉柄處分離提取柑橘黃龍病病菌的DNA，然后通過特異引物進行熒光定量PCR檢測，而且對樣品的處理和柑橘黃龍病病菌DNA的提取需要一定的技術和經驗，具有耗時長、技術難度高且檢測成本較高的缺陷，而且平均一個樣品的費用在150元-200元左右，極大限制了該方法的大規模田間應用；基于單克隆抗體技術進行檢測包括制備與黃龍病病菌的特異蛋白質結合而不與健康葉片發生結合的單克隆抗體，對柑橘黃龍病進行ELISA檢測，這種方法具有靈敏度高的特點，但是單克隆抗體生產成本高，而且通常需要低溫如-20℃到-80℃保藏，4℃保藏其中抗體中含有的蛋白酶雜質會將抗體逐漸分解，這使得該技術使用具有很大局限性；采用目測的方法來觀察黃龍病的有無是指農戶通常通過葉片是否斑駁，有無黃梢等來判斷是否有黃龍病，由于葉片的斑駁和黃稍容易和其他柑橘病癥或者營養缺素混淆，使該方法對于早期發病的樹無法做出準確的判斷。

由于柑橘黃龍病病菌堵塞維管束，并分泌毒性多肽干擾柑橘葉片正常的糖代謝，使得黃龍病病葉中淀粉有異常積累，基于碘淀粉反應的診斷方法進行檢測來源于Schneider(1968)發現黃龍病感染的葉片中淀粉含量很高，目前基于碘淀粉反應的診斷方法進行檢測包括將葉片剪切成細條狀，并在-4到-15℃冷凍12-24小時，進行脫色處理(除去葉綠素，排除葉綠素的影響)，在脫色后的葉片上直接滴加淀粉顯色液，用碘對葉片中淀粉進行顯色，如果葉片不變色，則為健康葉，如果變藍色則為黃龍病葉，從而快速診斷黃龍病；該方法操作時間長、不方便，不利于田間的即時檢測使用；而且該方法中忽略了淀粉是普遍存在于柑橘葉片的物質，任何葉片都有淀粉存在，健康的柑橘葉片中也含有淀粉，只是淀粉含量的多少有所不同，健康樹葉片的淀粉含量在一定范圍內也會和碘發生顯色反應，只是顯色的深淺和黃龍病樹葉片有所不同，而且由于柑橘黃龍病病菌分布的不均勻性，黃龍病病菌在一棵樹可能只是在某幾個枝條有較高的含量，在另外的枝條含量很少，這可能造成同為黃龍病樹的不同枝條間葉片的淀粉含量差異較大；因此采用該方法對凡是顯色的葉片進行簡單的陽性判定，會出現大量假陽性的現象，導致該方法的檢測結果不準確。

發明內容