[發明專利]一種提高冷凍卵母細胞體外培育質量的培養液及其應用

有效

• 申請號: 202210097053.4
• 申請日: 2022-01-26
• 公開（公告）號: CN114350600B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 傅祥偉;李俊;杜幸柱;顓清芮;侯云鵬
• 申請（專利權）人: 中國農業大學;河北醫科大學第一醫院
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075;A01N1/02
• 代理公司: 北京專贏專利代理有限公司 11797
• 代理人: 劉偉

本發明涉及一種提高冷凍卵母細胞體外培育質量的培養液及其應用。本發明提出的一種提高冷凍卵母細胞體外培育質量的培養液，在M16培養液中添加伴刀豆球蛋白A，通過調節皮質張力恢復冷凍卵母細胞機械特性從而提高冷凍卵母細胞體外培育質量。本發明首次提出通過調節皮質張力恢復冷凍卵母細胞機械特性從而提高冷凍卵母細胞體外培育質量的技術路線，明確了通過調節皮質張力可以恢復冷凍卵母細胞機械特性，增強紡錘體組裝檢驗點活性，降低非整倍體比例，進而提高冷凍卵母細胞體外培育的內在質量。本發同時給出ConA在M16培養液中的添加濃度為1?100μg/ml，優選10μg/ml。

技術領域

本發明涉及繁殖技術領域，具體涉及一種提高冷凍卵母細胞體外培育質量的培養液及其應用。

技術背景

卵母細胞冷凍技術是重要的生殖生物學技術，廣泛應用于種質資源保存、生育力保存及輔助生殖技術中，但解凍后卵母細胞存在發育潛能下降等問題，有報道稱至少冷凍20枚成熟卵母細胞方可獲得出生后代，嚴重制約了此項技術的廣泛應用，因此，提高冷凍卵母細胞利用效率是亟待解決的問題，對解凍損傷機制的深入解析是提高冷凍卵母細胞有效利用的前提。

卵母細胞發育經歷了由GV、GVBD(卵母細胞開始體外成熟后2.5h)至MII期(卵母細胞開始體外成熟后12h)的減數分裂過程，我們前期研究發現冷凍GV期卵母細胞體外成熟后非整倍體比例顯著升高，動粒-微管(kinetochore-microtubule,KT-MT)錯誤連接可造成染色體不正確分離。皮質位于質膜下，在維持細胞形狀及機械特性方面發揮重要作用。玻璃化冷凍中，卵母細胞在脫水-再水化過程中其體積也經歷了縮水-膨脹的形態學改變，其劇烈的體積變化勢必引起細胞機械力學的變化，研究也指出冷凍對卵母細胞細胞骨架及線粒體功能損傷最大，但目前皮質機械力學改變對冷凍卵母細胞質量的影響尚未見報道。

皮質張力是皮質細胞骨架收縮性的高度敏感讀數，反映了皮質的生化和結構特征。卵母細胞皮質張力主要由ERM家族蛋白、myosin-II、actin介導產生。Ezrin/Radixin/Moesin(ERM)家族及非肌肉肌球蛋白II是兩類調節卵母細胞皮質張力的重要蛋白，通過調控機械特性參與細胞極性建立，促進減數分裂進程。磷酸化的ERM(phosphor-ERMs，pERM)是ERM的活性形式，而磷酸化的肌球蛋白調節輕鏈蛋白(phosphorylation?of?myosinregulatory?light?chain，pMRLC)可調節肌球蛋白II活性，其中，pERM水平與皮質張力正相關，pMRLC在胞質中的分布水平與皮質張力呈負相關。卵母細胞發育過程中皮質區域的重塑和機械性能的變化對減數分裂的完成以及受精、胚胎發育具有重要意義。

目前，市場上現有冷凍、解凍試劑普遍為滲透性及非滲透性冷凍保護劑，通過置換卵母細胞內水分，防止冷凍解凍過程中冰晶形成以達到保護卵母細胞的目的，沒有針對調節皮質張力改善冷凍卵母細胞質量的凍存體系。

發明內容

為了解決以上問題，本發明提出一種提高冷凍卵母細胞體外培育質量的培養液及其應用。

本發明提出的一種提高冷凍卵母細胞體外培育質量的培養液，在M16培養液中添加伴刀豆球蛋白A，通過調節皮質張力恢復冷凍卵母細胞機械特性從而提高冷凍卵母細胞體外培育質量。

進一步，所述刀豆球蛋白A的添加濃度為1-100μg/ml。

進一步，所述刀豆球蛋白A的添加濃度為10μg/ml。

本發明同時提出一種提高冷凍卵母細胞體外培育質量的方法，包括如下步驟：

S1、采集GV期卵母細胞并置于M2液滴中備用；

S2、將卵母細胞轉移至平衡液中30秒，隨后轉移至玻璃化冷凍液中20-30秒，然后迅速將卵母細胞置于載桿前端，投入液氮；

S3、解凍時，將S2所述載桿迅速從液氮中取出，置于含0.5M蔗糖的PBS中作用5min，然后用M2液清洗三遍后備用；