[發(fā)明專利]一種人源超氧化物歧化酶hSOD1突變體的制備及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210095372.1
• 申請(qǐng)日: 2022-01-26
• 公開（公告）號(hào): CN114480445B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃新河;楊方瑤;簡(jiǎn)甜甜;段嘉欣;劉汶東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N15/70;C12N9/02;C12N1/21;A61K8/66;A61K38/44;A61P17/16;A61Q19/08;A23L33/00;C12R1/19
• 代理公司: 成都信博專利代理有限責(zé)任公司 51200
• 代理人: 卓仲陽(yáng)

本發(fā)明提供一種人源超氧化物岐化酶hSOD1突變體制備方法及其應(yīng)用，涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。提供一種人源超氧化物歧化酶hSOD1突變體的編碼蛋白，其具有SEQIDNO.Mt1SOD1aa所示氨基酸序列；提供一種編碼上述蛋白的Mt1SOD1基因，具有SEQIDNO.Mt1SOD1所示核苷酸序列。本發(fā)明以人源hSOD1為模板，通過基因突變獲得了hSOD1突變體Mt1SOD1(E25G、P29T、E101V、C112S)基因，重組人源超氧化物歧化酶hSOD1突變體Mt1SOD1蛋白；在應(yīng)用上解決了異源性問題。且具備高活性高穩(wěn)定性，對(duì)新型功能型抗衰妝品及系列產(chǎn)品的開發(fā)、其他抗衰產(chǎn)品如功能食品、抗衰藥品的開發(fā)提供了新的途徑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人源超氧化物歧化酶hSOD1突變體的制備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

超氧化物歧化酶(Superoxide?Dismutase,SOD)是一種普遍存在于各類生物體中的活性物質(zhì)，是生物體內(nèi)最核心的自由基清除酶，能夠?qū)Ｒ坏厍宄龣C(jī)體內(nèi)細(xì)胞代謝過程中超氧陰離子，被稱為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線。SOD可減少由光照黑色素耗氧過多而產(chǎn)生的氧自由基，防止過多的黑色素形成，同時(shí)也可不斷地清除由脂褐素和蠟樣質(zhì)產(chǎn)生的氧自由基，避免過多的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，減少脂褐素和蠟樣質(zhì)的形成。此外機(jī)體中SOD的活性升高可減輕組織細(xì)胞過氧化性損傷，降低脂類過氧化物的形成，加強(qiáng)分解體內(nèi)過多的脂質(zhì)過氧化物。SOD不僅具有延緩皮膚衰老的功能，還在機(jī)體氧化應(yīng)激、抗炎修復(fù)、抗皺等方面起重要作用，現(xiàn)已被廣泛運(yùn)用于醫(yī)療、食品以及化妝品行業(yè)。

目前重組SOD1已成功在大腸桿菌、畢赤酵母、乳酸菌、聚球藻、山羊乳腺細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，然而，到目前為止，這些系統(tǒng)還沒有能夠大規(guī)模生產(chǎn)出產(chǎn)量和活性都令人滿意的重組Cu/Zn-SOD(SOD1)。牦牛屬于牛屬牦牛亞屬牦牛種，青藏高原高寒缺氧的惡劣環(huán)境使其體內(nèi)的SOD活性隨含氧量的降低而升高，從牦牛血中提取的牦牛SOD1活性高達(dá)13000U。例如發(fā)明專利201010169323.5號(hào)重組表達(dá)牦牛SOD1的文獻(xiàn)，但仍然是傳統(tǒng)的動(dòng)物提取出來的SOD，存在穩(wěn)定性較差，表達(dá)水平不穩(wěn)定，活性難以保持等缺陷?；谀壳艾F(xiàn)有技術(shù)中重組Cu/Zn-SOD(SOD1)存在的缺陷，本研究以hSOD1為模板，利用生物信息學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)比牦牛SOD1基因序列，得到hSOD1突變體，重組出來的突變體也是人源的，在應(yīng)用上解決了異源性問題。

本發(fā)明通過對(duì)人源hSOD1進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)優(yōu)化，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)化發(fā)酵及純化條件，獲得高活性高穩(wěn)定性的重組人源hSOD1突變體。此重組人源hSOD1突變體可應(yīng)用于新型功能型抗衰妝品，且可用于系列產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)以及其他抗衰品(如功能食品、抗衰藥品)的開發(fā)應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種人源hSOD1突變體的制備方法及其應(yīng)用。公開了人源超氧化物歧化酶hSOD1突變體的編碼蛋白，其具有SEQ?ID?NO.Mt1SOD1?aa所示的氨基酸序列；

本發(fā)明以hSOD1為模板，利用生物信息學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)比牦牛SOD1基因序列，得到人源超氧化物歧化酶hSOD1突變體Mt1SOD1(E25G、P29T、E101V、C112S)基因，命名為Mt1SOD1。

本發(fā)明公開了一種編碼上述蛋白的Mt1SOD1基因，具有SEQ?ID?NO.Mt1SOD1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還公開了一種含有上述基因的pET-28a(+)-Mt1SOD1表達(dá)載體以及含有所述載體的BL21(DE3)-pET28a(+)-Mt1SOD1工程菌。

一種重組人源超氧化物歧化酶hSOD1突變體Mt1SOD1的制備方法，步驟如下：

(1)NCBI獲取序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，5‘端添加6×His-tag標(biāo)簽，化學(xué)合成5‘端具有6×His-tag編碼序列的hSOD1、Mt1SOD1基因，化學(xué)合成由擎科公司代理完成；