[發明專利]一種牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體、制備方法及其用途

在審

• 申請號: 202210094006.4
• 申請日: 2022-01-26
• 公開（公告）號: CN114369159A
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 朱建國
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C12N15/13;C12N15/85;G01N33/569;A61K39/40;A61P31/04;A61P15/14;A61P29/00
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

1.一種牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體，其特征在于，包括輕鏈可變區VL、重鏈可變區VH、連接肽Linker，并按照VL-Linker-VH的順序連接構成牛源單鏈抗體片段VL-Linker-VH，所述輕鏈可變區VL氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重鏈可變區VH氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根據權利要求1所述的牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體，其特征在于，所述牛源單鏈抗體片段VL-Linker-VH氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.一種DNA分子，其特征在于包括編碼權利要求1或2所述的牛源單鏈抗體片段VL-Linker-VH。

4.一種抑制奶牛乳腺炎的藥物，其特征在于，該藥物包括權利要求1或2所述的牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體。

5.一鐘檢測奶牛乳腺炎的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1或2所述的牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體，或者含有權利要求3所述的DNA分子。

6.一種牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、PCR擴增輕鏈可變區VL和重鏈可變區基因VH，合成scFv基因

采用RT-PCR擴增抗體編碼基因的輕鏈可變區VL基因和重鏈可變區基因VH基因；利用SOE-PCR法將連接輕鏈可變區VL基因和重鏈可變區VH基因，構建牛源性單鏈抗體基因，即scFv基因；

步驟2、建立初級單鏈抗體文庫

將所述scFv基因插入pCANTAB5E載體，構建重組表達質粒；

將重組質粒轉化入大腸桿菌，培養并用輔助噬菌體擴增建立初級單鏈抗體文庫；

步驟3、牛源抗金黃色葡萄球菌單鏈抗體的篩選；

用金黃色葡萄球菌全菌抗原，包被96孔板重復3～5輪富集淘選；

從最后一輪淘選中隨機取96個克隆，采用phage ELISA篩選陽性克隆；

步驟4、真核表達單鏈抗體

將牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體VL-Linker-VH編碼基因scFv插入真核表達載體pcDNA3.1，構建成單鏈抗體真核表達質粒pcDNA3.1-scFv，轉染COS-1細胞。

7.根據權利要求6所述的牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體的制備方法，其特征在于，步驟1中，PCR擴增引物為VL F、VL R、VH F和VH R，核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，VLF、VH R分別含有SfiI和Not I酶切位點，VH F、VL R含互補的Linker序列。

8.根據權利要求6所述的牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體的制備方法，其特征在于，PCR反應體系為25μL：2×PCR mix 12.5μL，模版cDNA 2μL，25μM上下游引物各1μL，ddH₂O 8.5μL，PCR擴增程序：95℃預變性3min；94℃變性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30個循環；最后72℃延伸10min。

9.根據權利要求6所述的牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體的制備方法，其特征在于，富集淘選第一輪過后，洗脫前用PBST洗脫20次，用PBS再洗滌20次。

10.一種根據權利要求1或2所述單鏈抗體或權利要求6～9任一項所述方法得到的單鏈抗體應用，其特征在于，將其用于在金黃色葡萄球菌感染的乳腺組織中，抑制炎性細胞的浸潤。