[發(fā)明專利]一種牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體、制備方法及其用途

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• 申請日: 2022-01-26
• 公開（公告）號: CN114369159A
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發(fā)明（設計）人: 朱建國
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C12N15/13;C12N15/85;G01N33/569;A61K39/40;A61P31/04;A61P15/14;A61P29/00
• 代理公司: 上海旭誠知識產(chǎn)權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發(fā)明公開了一種牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體、制備方法及其應用，真核表達單鏈抗體包括輕鏈可變區(qū)VL、重鏈可變區(qū)VH、連接肽Linker，并按照VL?Linker?VH的順序連接構成牛源單鏈抗體片段VL?Linker?VH，所述輕鏈可變區(qū)VL氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重鏈可變區(qū)VH氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明構建的單鏈抗體在體內(nèi)持續(xù)時間長，能顯著提高細胞因子IFN?γ和IL?4的含量,降低炎癥因子TNF?α的含量，維持乳腺結構的相對完整，減少炎性細胞的浸潤，對小鼠提供一定的保護作用。

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程領域，尤其涉及一種牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體、制備方法及其用途。

背景技術

奶牛乳腺炎是影響奶牛業(yè)發(fā)展，給乳品生產(chǎn)造成巨大損失的一種常見多發(fā)病，其中，因為金黃色葡萄球菌具有傳染性且治療用的抗生素易產(chǎn)生耐藥性，是引起奶牛乳腺炎最重要的致病菌，流行率達到了50％，導致的經(jīng)濟損失最大，且很難徹底治愈。目前針對金黃色葡萄球菌全菌和各個毒力因子的疫苗也用于奶牛乳腺炎的預防，但是效果均不理想。

單鏈抗體是一種基因工程抗體，通過DNA重組技術將抗體輕鏈可變區(qū)VL和重鏈可變區(qū)VH通過一段連接短肽linker首尾連接而成，是保留完整抗原結合部位的最小功能片段。單鏈抗體的表達形式主要有融合表達，胞內(nèi)表達和分泌表達三種形式。和完整抗體相比，單鏈抗體具有以下優(yōu)點：1)分子量小，大小僅為完整抗體的六分之一，免疫原性較低；2)組織穿透力強，容易進入實體瘤周圍的微循環(huán)；3)血液清除快，腎臟蓄積很少；4)無Fc段，非特異結合低；5)易于通過基因工程大量生產(chǎn)；6)易于基因操作，更易構建重組免疫毒素。

故本領域迫切需要開發(fā)免疫原性低、高特異性、能大規(guī)模工程化制備的牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于現(xiàn)有技術的上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體、制備方法及其用途。

本發(fā)明的技術原理是采用RT-PCR直接從患奶牛乳腺炎的外周血單個核細胞RNA中擴增出牛抗體編碼基因的重鏈可變區(qū)VH基因和輕鏈可變區(qū)VL基因。

利用SOE-PCR(重組鏈延伸反應)法，將linker與VH基因和VL基因相連構建牛源性單鏈抗體編碼基因(scFv)，該scFv是按照VL-Linker-VH的順序進行連接的，并將其克隆到噬菌粒載體pCANTAB5E中構建單鏈抗體初級文庫，輔助噬菌體M13KO7拯救初級文庫；用金黃色葡萄球菌全菌作為包被抗原，經(jīng)過四輪的富集淘選后，采用phage ELISA方法篩選陽性克隆，證明該單鏈抗體具有抗金黃色葡萄球菌的體外中和活性，并測序后進行Clustalw多序列比較。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體，包括輕鏈可變區(qū)VL、重鏈可變區(qū)VH、連接肽Linker，并按照VL-Linker-VH的順序連接構成牛源單鏈抗體片段VL-Linker-VH，所述輕鏈可變區(qū)VL氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重鏈可變區(qū)VH氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述牛源單鏈抗體片段VL-Linker-VH氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種DNA分子，編碼所述牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種抑制奶牛乳腺炎的藥物，該藥物包括所述牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體。

本發(fā)明的第四方面，提供了一鐘檢測奶牛乳腺炎的試劑盒，該試劑盒包括所述牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體，或者含有權力要求3所述的DNA分子。

本發(fā)明的第五方面，提供了一種牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體的制備方法，包括以下步驟：