[發(fā)明專利]一種增強同源重組能力的酵母基因工程菌及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210093953.1
• 申請日: 2022-01-26
• 公開（公告）號: CN114456963A
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發(fā)明（設計）人: 連佳長;高炬燦;董昌
• 申請（專利權）人: 浙江大學杭州國際科創(chuàng)中心
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/90;C12N15/81;C12N15/31;C12R1/84
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發(fā)明公開了一種增強同源重組能力的酵母基因工程菌及其應用，涉及生物工程領域。所述酵母基因工程菌，以酵母作為出發(fā)菌株，通過導入基因構建獲得所述酵母基因工程菌，導入基因包括以下任意一組：(1)RAD52基因、RAD59基因和MRE11基因；(2)RAD52基因和RAD59基因；(3)RAD52基因和MRE11基因；(4)RAD52基因和SAE2基因；(5)RAD52基因；(6)RAD52基因、RAD59基因、MRE11基因和SAE2基因。本發(fā)明的酵母基因工程菌能夠實現(xiàn)具有約40bp同源臂的異源基因表達盒的單、二和三基因同時整合，效率分別高達100％、約98％和約81％。

技術領域

本發(fā)明涉及生物工程領域，具體涉及一種增強同源重組能力的酵母基因工程菌及其應用。

背景技術

畢赤酵母(Pichia pastoris)能在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中生長，具有蛋白高表達的特性，不僅擁有真核生物中最強的甲醇誘導型啟動子pAOX1，還可以進行高密度發(fā)酵，利于工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)，被認為是最具發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質的宿主之一。建立甲基營養(yǎng)酵母畢赤酵母作為生產(chǎn)燃料、化學品和天然產(chǎn)品的微生物細胞工廠受到越來越多的關注，特別是以甲醇為原料。

考慮到游離質粒的穩(wěn)定性和代謝負擔問題，通常采用基因組整合來高效表達外源基因。雖然在畢赤酵母中已經(jīng)建立了CRISPR基因編輯技術，并用于多基因生物合成途徑的整合，但僅限于少數(shù)的幾個例子，且通常需要較長的同源臂(500-1000bp)，同源臂通常是指打靶載體上待插入的外源序列兩側的與基因組序列完全一致的側翼序列，用于識別并發(fā)生重組的區(qū)域。巴斯德畢赤酵母中的同源重組效率較低，通常需要較長的同源片段，隨著同源臂長度的降低，編輯效率也會顯著下降。因此，利用較短的單鏈寡核苷酸片段在酵母中實現(xiàn)高效的基因編輯成為研究熱點。盡管在一些微生物中已能利用寡核苷酸介導的基因重組對基因組進行定點突變，但在酵母中的低重組效率限制其在酵母基因組進化中的應用。因此，亟需通過基因工程手段進行改造和提升。

破壞非同源端連接(non-homologous end joining，NHEJ)相關基因(即KU70基因)已被發(fā)現(xiàn)是提高同源重組效率的有效策略，可以顯著的提高同源重組的效率，在長同源臂的情況下(1000bp)，三位點同時整合的效率可達到12.5％-32％(Liu,Q.,Shi,X.,Song,L.,Liu,H.,Zhou,X.,Wang,Q.,Zhang,Y.,and Cai,M.CRISPR-Cas9-mediated genomicmultiloci integration in Pichia pastoris.Microbial Cell Factories,2019,18,144.doi:10.1186/s12934-019-1194-x)。但KU70基因敲除菌株的轉化子會大大減少，且存在染色體末端大片段丟失的可能(Ito,Y.,Watanabe,T.,Aikawa,S.,Nishi,T.,Nishiyama,T.,Nakamura,Y.,Hasunuma,T.,Okubo,Y.,Ishii，J.,and Kondo,A.Deletion of DNAligase IV homolog confers higher gene targeting efficiency on homologousrecombination in Komagataella phaffii.FEMS Yeast Research,2018,18.doi:10.1093/femsyr/foy074)。在不干擾NHEJ的情況下提高同源重組效率是構建畢氏酵母細胞工廠的迫切要求。

發(fā)明內容

為了在畢赤酵母中實現(xiàn)具有短同源臂的異源基因的高效基因組整合，我們旨在通過引入釀酒酵母的重組機制來提高其同源重組效率。本發(fā)明過表達了釀酒酵母的的HR相關基因，包括RAD52基因、RAD59基因、MRE11基因和SAE2基因，并評估它們對基因組整合效率的影響。同時構建了HR相關基因效率增強型畢赤酵母。