[發(fā)明專利]一種增強(qiáng)同源重組能力的酵母基因工程菌及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210093953.1
• 申請(qǐng)日: 2022-01-26
• 公開（公告）號(hào): CN114456963A
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 連佳長(zhǎng);高炬燦;董昌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)杭州國(guó)際科創(chuàng)中心
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/90;C12N15/81;C12N15/31;C12R1/84
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

1.一種增強(qiáng)同源重組能力的酵母基因工程菌，其特征在于，以酵母作為出發(fā)菌株，通過導(dǎo)入基因構(gòu)建獲得所述酵母基因工程菌，導(dǎo)入基因包括以下任意一組：

(1)RAD52基因、RAD59基因和MRE11基因；

(2)RAD52基因和RAD59基因；

(3)RAD52基因和MRE11基因；

(4)RAD52基因和SAE2基因；

(5)RAD52基因；

(6)RAD52基因、RAD59基因、MRE11基因和SAE2基因。

2.如權(quán)利要求1所述的酵母基因工程菌，其特征在于，所述出發(fā)菌株為釀酒酵母或畢赤酵母。

3.如權(quán)利要求1所述的酵母基因工程菌，其特征在于，導(dǎo)入基因時(shí)，RAD52基因整合位點(diǎn)為HIS4位點(diǎn)；RAD59基因整合位點(diǎn)為Int11位點(diǎn)；MRE11基因整合位點(diǎn)為Int20位點(diǎn)；SAE2基因整合位點(diǎn)為Int8位點(diǎn)；其中，HIS4位點(diǎn)為畢赤酵母GS115常用的外源基因整合位點(diǎn)；Int11位點(diǎn)為上游ORF為PAS_chr3_1156，下游ORF為PAS_chr3_0154；Int20位點(diǎn)為上游ORF為PAS_chr4_0465，下游ORF為PAS_chr4_0467；Int8位點(diǎn)為上游ORF為PAS_chr2-1_0528，下游ORF為PAS_chr2-1_0530。

4.如權(quán)利要求1所述的酵母基因工程菌，其特征在于，所述RAD52基因?yàn)閬碓从卺劸平湍窧Y4741的RAD52基因或來源于畢赤酵母GS115的RAD52基因，其中，來源于釀酒酵母BY4741的RAD52基因的GeneBank號(hào)為854976，來源于畢赤酵母GS115的RAD52基因的NCBI基因編號(hào)ID：CAY68760；所述RAD59基因來源于釀酒酵母BY4741，GeneBank號(hào)為851500；所述MRE11基因來源于釀酒酵母BY4741，GeneBank號(hào)為855264；所述SAE2基因來源于釀酒酵母BY4741，GeneBank號(hào)為852700。

5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述酵母基因工程菌的制備方法，其特征在于，導(dǎo)入基因包括RAD52基因、RAD59基因和MRE11基因，所述制備方法包括以下步驟：

(1)通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)將Cas9核酸酶編碼基因整合到畢赤酵母GS115的HIS4位點(diǎn)上，獲得菌株P(guān)p；

(2)將RAD52基因整合到步驟(1)中獲得的菌株P(guān)p的HIS4位點(diǎn)上，獲得菌株P(guān)pHR1；

(3)將RAD59基因整合到步驟(2)中獲得的菌株P(guān)pHR1的Int11位點(diǎn)上，獲得菌株P(guān)pHR2；

(4)將MRE11基因整合到步驟(3)中獲得的菌株P(guān)pHR2的Int20位點(diǎn)上，獲得菌株P(guān)pHR3，即為所述酵母基因工程菌。

6.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述酵母基因工程菌在整合異源合成途徑的基因中的應(yīng)用。

7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，在整合異源合成途徑的基因時(shí)，采用同源重組的方式整合，同源重組時(shí)采用同源臂的長(zhǎng)度至少為40bp。

8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，同源重組時(shí)采用同源臂的長(zhǎng)度為40～1000bp。

9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，同源重組時(shí)采用同源臂的長(zhǎng)度為40～500bp。

10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，同源重組時(shí)采用同源臂的長(zhǎng)度為40bp。