[發(fā)明專(zhuān)利]DPH6基因在制備具有毒素抗性細(xì)胞系中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210085844.5
• 申請(qǐng)日: 2022-01-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114410680B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梅峰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 乾元康安（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;C12N15/65;C12N15/55;C12N9/22;C12N15/113;C12N15/31;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 北京預(yù)立生科知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11736
• 代理人: 朱萍

本發(fā)明公開(kāi)了DPH6基因在制備具有毒素抗性細(xì)胞系中的應(yīng)用。本發(fā)明的研究證明敲除DPH6基因可導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)DT產(chǎn)生耐受性，因此通過(guò)基因工程手段抑制細(xì)胞中DPH6基因表達(dá)可制備具有毒素抗性的細(xì)胞系。本發(fā)明的具有毒素抗性細(xì)胞系可用于制備抗體偶聯(lián)藥物，生產(chǎn)效率高且獲得的產(chǎn)品穩(wěn)定，在臨床使用時(shí)可極大降低用藥副作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及DPH6基因在制備具有毒素抗性的細(xì)胞系中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)是由棒狀白喉?xiàng)U菌分泌的一種毒素。DT毒素有553個(gè)氨基酸。白喉酰胺是蛋白質(zhì)翻譯延伸因子EF2蛋白組氨酸殘基上一個(gè)特殊的修飾。它廣泛存在于古細(xì)菌和真核生物，包括人類(lèi)。白喉毒素正是通過(guò)識(shí)別白喉酰胺對(duì)EF2進(jìn)一步修飾，從而使蛋白質(zhì)合成停止，細(xì)胞死亡。

綠膿桿菌外毒素，又稱(chēng)為假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A，PE)的單個(gè)多肽鏈?zhǔn)怯?個(gè)區(qū)域組成，其中區(qū)域三(氨基酸405-613)主要是毒素催化區(qū)，負(fù)責(zé)抑制蛋白的合成和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，機(jī)制同白喉毒素。

抗體偶聯(lián)藥物(antibody drug conjugates，ADCs)是單克隆抗體與抗腫瘤毒性小分子的偶聯(lián)產(chǎn)物。抗腫瘤毒性小分子可通過(guò)抑制DNA、RNA、蛋白合成、細(xì)胞分裂等對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。抗體毒素偶聯(lián)物的生產(chǎn)系統(tǒng)包括原核細(xì)胞系統(tǒng)和真核細(xì)胞系統(tǒng)，真核細(xì)胞系統(tǒng)又包括酵母系統(tǒng)、昆蟲(chóng)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)。抗體毒素偶聯(lián)物制備的前提是生產(chǎn)系統(tǒng)需要對(duì)表達(dá)的毒素具有抗性才能保證抗體毒素偶聯(lián)物的大量產(chǎn)出。本申請(qǐng)的研究目的就在于提供一種具有毒素抗性的細(xì)胞株以生產(chǎn)穩(wěn)定共價(jià)鍵連接的抗體毒素偶聯(lián)物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于通過(guò)基因工程的手段，對(duì)現(xiàn)有蛋白生產(chǎn)細(xì)胞株進(jìn)行改造，使其對(duì)偶聯(lián)藥物毒性耐受，并直接生產(chǎn)蛋白藥物偶聯(lián)物，使其由穩(wěn)定共價(jià)鍵連接，避免蛋白藥物偶聯(lián)物的不穩(wěn)定性產(chǎn)生的副作用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供具體方案如下：

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備具有毒素抗性細(xì)胞系或提高細(xì)胞系的毒素耐受性的方法，所述方法包括抑制DPH6基因表達(dá)。

進(jìn)一步，所述毒素是ADP-核糖基化毒素。

進(jìn)一步，所述毒素包括但不限于DT、PE、皂草素、明膠肽、全溶素、李斯特菌素、α-溶血素、枯草桿菌酶細(xì)胞毒素、布干維爾素或蓖麻毒素。

優(yōu)選地，所述毒素是白喉毒素或PE。

進(jìn)一步，細(xì)胞系包含來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，優(yōu)選人或小鼠細(xì)胞系的細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可以是癌細(xì)胞，如A431，A549，HCT116，K562，Hela；可以是正常的非癌細(xì)胞，如HEK-293，CHO；優(yōu)選地，HEK-293細(xì)胞是freestyle 293F細(xì)胞。

進(jìn)一步，抑制DPH6基因表達(dá)的方法包括基因敲除技術(shù)、反義核苷酸技術(shù)、RNAi技術(shù)。

可用于本發(fā)明的基因敲除技術(shù)包括CRISPR技術(shù)、鋅指酶ZFN技術(shù)、TALEN技術(shù)。

優(yōu)選地，基因敲除技術(shù)使用的是CRISPR技術(shù)；

更優(yōu)選地，CRISPR技術(shù)使用的是CRISPR/Cas系統(tǒng)；

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，CRISPR/Cas系統(tǒng)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)。

RNAi技術(shù)抑制基因表達(dá)使用的試劑包括如下：雙鏈RNA，短發(fā)夾RNA(shRNA)或微小RNA(shRNAmir)。

具體地，所述方法包括如下步驟：

1)將靶向DPH6基因或其轉(zhuǎn)錄物的核酸分子導(dǎo)入所選細(xì)胞中；

2)培養(yǎng)經(jīng)步驟1)處理的細(xì)胞。