[發明專利]轉基因玉米BFL4-2轉化體特異性實時熒光定量PCR檢測引物、檢測方法

在審

• 申請號: 202210085433.6
• 申請日: 2022-01-25
• 公開（公告）號: CN114410822A
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 苗朝華;金蕪軍;劉衛曉;宛煜嵩;董美;高進;黃衛紅;王迪;文婷婷;孟麗霞
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京知匯林知識產權代理事務所(普通合伙) 11794
• 代理人: 董濤

本發明公開了一種轉基因玉米BFL4?2轉化體特異性定量PCR檢測引物、檢測方法。特異性引物對為：BFL4?2?qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；BFL4?2?qR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。特異性探針為：BFL4?2?P，其序列如序列表SEQ ID No.3。采用本發明的引物對與探針進行實時熒光定量PCR反應，可以鑒定樣品中是否含有轉基因玉米BFL4?2品系，并能對其含量進行準確定量。

技術領域

本發明涉及一種轉基因材料的定量檢測引物，特別涉及一種轉基因玉米BFL4-2轉化體特異性實時熒光定量PCR檢測引物及其檢測方法。

背景技術

隨著轉基因作物在全球的種植面積不斷擴大，轉基因產品的安全性問題引起了世界各國普遍的關注。近年來，關于轉基因產品的安全性事件報道不斷，盡管有些報道缺乏事實依據，但卻更加引起了公眾的重視和擔憂，而我國尚未建立轉基因產品標識制度。

目前，轉基因檢測主要有兩個大類：一種是在核酸水平上進行檢測，另一種是在蛋白質水平上進行檢測。在核酸水平上進行檢測通常以DNA為模板采用PCR的基礎方法進行檢測。在應用PCR技術進行轉基因作物定性檢測時，根據其特異性，將其分為篩選檢測法、基因特異性方法、構建特異性方法和轉化體特異性方法。轉化體特異性方法是通過檢測外源DNA與染色體連接區的序列來實現的。由于連接區序列的特異性，因而該方法準確性高，最適用于轉基因產品檢測。

實時熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性好和可靠性強的特點，既可以避免定性PCR假陽性現象，又可以對樣品中轉基因含量進行定量，因而在轉基因檢測中具有廣闊前景。轉基因玉米BFL4-2是由中國農業科學院生物技術研究所研發的抗蟲耐除草劑玉米，抗草甘膦、抗鱗翅目昆蟲，目前已進入生產性試驗階段，具有極高的產業化應用潛力。迄今為止，國內外還沒有用于轉基因玉米BFL4-2定量PCR檢測的方法，制定轉基因玉米BFL4-2轉化體特異性實時熒光定量PCR檢測方法對于我國轉基因生物安全監管、促進我國玉米產業的健康發展具有重要意義。

發明內容

本發明的目的之一是提供用于檢測轉基因玉米BFL4-2的轉化體特異性實時熒光定量PCR檢測引物和探針；所述特異性檢測正向引物為：BFL4-2-qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；反向引物為：BFL4-2-qR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

與其匹配的探針為：BFL4-2-P，探針序列如序列表SEQ ID No.3所示。

本發明的目的之二是建立一種轉基因玉米BFL4-2的轉化體特異性實時熒光定量PCR定量方法；

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

(1)提取待測樣品DNA；

(2)以提取的水稻樣品的DNA為模板，同時設置玉米內標準基因和轉基因玉米BFL4-2轉化體特異性實時熒光定量PCR反應體系，對標準梯度樣品和待測樣品進行檢測；

(3)運行實時熒光定量PCR反應，若待測樣品中轉化體特異性實時熒光PCR反應體系沒有擴增信號出現，則證明待測樣品中不含有轉基因玉米BFL4-2品系；

(4)若轉化體特異性實時熒光PCR反應體系擴增出熒光信號，則證明樣品中含有轉基因玉米BFL4-2，根據標準梯度樣品讀取的熒光PCR反應的Ct值，以Ct值為Y軸，基因組DNA拷貝數的對數為X軸，繪制標準曲線Ct＝k×Lg(Copies)+b，分別得到一條外源基因標準曲線方程和一條內標準基因標準曲線方程，再將待測樣品的Ct值帶入方程即得到了外源基因和內標準基因的拷貝數，然后按下述公式計算轉基因含量：樣品中轉基因玉米BFL4-2的含量％＝外源基因拷貝數/內標準基因拷貝數×100。