[發明專利]結合生物基質膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法

在審

• 申請號: 202210084503.6
• 申請日: 2022-01-25
• 公開（公告）號: CN114540302A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 李桂蘭;劉奕志;鄭穎豐
• 申請（專利權）人: 中山大學中山眼科中心
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/074
• 代理公司: 北京翔石知識產權代理事務所(普通合伙) 11816
• 代理人: 李勇

本發明涉及一種結合生物基質膠生成hiPSC?RPE細胞膜片的方法，包括，步驟S1，將預處理后的豬眼葡萄膜制備脫細胞基質膠；步驟S2，維持培養hiPSCs；步驟S3，培養hiPSC?RPE懸浮球；步驟S4，hiPSC?RPE細胞擴增培養；步驟S5,生成hiPSC?RPE細胞膜片；其中，所述步驟S5中，將濃度為1％的Uvea?Gel包被培養皿，于37℃放置30min左右，待Uvea?Gel凝固，形成一層薄薄的膜樣區域為BM膜，用以模擬天然BM微環境。本發明優化出從豬脈絡膜組織分離制備脫細胞基質水凝膠，結合建立的hiPSC誘導3D視網膜分化系統，獲得hiPSC?RPE細胞，建立模擬Bruch膜(BM)微環境的生成RPE片的方法，為培養GMP級別干細胞提供安全有效的生物材料。

技術領域

本發明涉及hiPSC-RPE細胞膜片領域，尤其涉及一種結合生物基質膠生成 hiPSC-RPE細胞膜片的方法。

背景技術

在室溫條件下，基質膠Matrigel聚合形成具有生物學活性的三維基質，模 擬體內細胞基底膜的結構、組成、物理特性和功能，有利于體外細胞的培養和分 化，可用于對細胞形態、生化功能、遷移、侵染和基因表達等的研究。目前基質 膠均從富含胞外基質蛋白的EHS小鼠腫瘤中提取出基底膜基質，其主要成分有層 粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，還包含生長因子和基質金屬蛋 白酶等。

現有RPE sheets的制備主要依據合成材料，其與天然的BM膜的環境有很多 差異，尚無用hiPSC來源RPE證明在Uvea-Gel上的安全性和有效性。因此，設 計一種水凝膠代替目前臨床中使用的羊膜，更真實的模擬BM微環境，借助hiPSCs 向3D視網膜分化體系，開發成GMP級別的hiPSC-RPE片，促進臨床轉化和應用 是現階段工作重點。

發明內容

為此，本發明提供一種結合生物基質膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法，優 化出從豬脈絡膜組織分離制備脫細胞基質水凝膠，結合建立的hiPSC誘導3D視 網膜分化系統，獲得hiPSC-RPE細胞，建立模擬Bruch膜(BM)微環境的生成 RPE片的方法，為培養GMP級別干細胞提供安全有效的生物材料。

為實現上述目的，本發明提供一種結合生物基質膠生成hiPSC-RPE細胞膜片 的方法，包括：

步驟S1，將預處理后的豬眼葡萄膜制備脫細胞基質膠；

步驟S2，維持培養hiPSCs；

步驟S3，培養hiPSC-RPE懸浮球；

步驟S4，hiPSC-RPE細胞擴增培養；

步驟S5,生成hiPSC-RPE細胞膜片；

其中，所述步驟S5中，將濃度為1％的Uvea-Gel包被培養皿，于37℃放置 30min左右，待Uvea-Gel凝固，形成一層薄薄的膜樣區域為BM膜，用以模擬天 然BM微環境。

進一步地，所述步驟S1中，預處理后的豬眼葡萄膜經兩輪浸泡后冷凍干燥 形成脫細胞基質粉末，脫細胞基質粉末用胃蛋白酶酶解后，與0.1N氫氧化鈉溶 液中和形成脫細胞基質膠。

進一步地，第一輪浸泡依次采用5％Triton X-100浸泡4h，5％SDS浸泡4h， 4M尿素浸泡4h，用去離子水浸泡1.5h，第二輪浸泡依次采用1％Triton X-100 浸泡3h，PBS洗15min，1％Triton X-100浸泡18h。

進一步地，在所述步驟S2中，將hiPSCs接種于脫細胞基質膠包被的培養板， 于mTeSR1(Stem Cell)培養基中維持培養4-5天，選取克隆密度長至約80％-90％ 底面積時進行傳代。